Лабораторная диагностика гельминтозов

БЕЛОРУССКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ

РЕФЕРАТ

НА ТЕМУ:

"ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ГЕЛЬМИНТОЗОВ"

МИНСК, 2009

Для обнаружения гельминтов, их фрагментов (проглоттид. с кодексов), личинок или яиц исследуют кал, мочу, мокроту, дуоденальное содержимое, кровь.

Исследование испражнений (копрологическое исследование) является наиболее распространенным, так как большая часть гельминтов паразитирует у человека в кишечнике или органах, связанных с ним протоками, поэтому их яйца или части тела выделяются с испражнениями.

При копрологическом анализе необходимо строго соблюдать правила личной гигиены, обжигать петли и стеклянные палочки, стерилизовать посуду, стекла и инструментарий, содержать в чистоте рабочее место.

Испражнения исследуют макроскопически или микроскопически хотя обнаружения в них паразитических червей или их частей (гельминтоскопия), а главным образом - яиц гельминтов (гельминтоовоскопия).

Макроскопические методы

Осмотр испражнений.

При осмотре испражнений в них можно обнаружить гельминтов, их сколексы, обрывки стробилы, проглоттиды, выделяющиеся самостоятельно или после дегельминтизации. Этот метод особенно рекомендуется для выявления энтеробиоза, тениоза и тениаринхоза.

Испражнения доставляют в лабораторию в чистой стеклянной посуде или в спичечных коробках. На каждой коробке должна быть этикетка с указанием фамилии, имени, возраста и места жительства обследуемого.

Небольшие порции испражнений перемешивают с водой в плоской ванночке или в чашке Петри. Их просматривают при хорошем освещении на темном фоне, при необходимости пользуясь лупой.

Пинцетом или пипеткой извлекают все подозрительные образования, переносят на предметное стекло в каплю разведенного глицерина или изотонического раствора хлорида натрия для дальнейшего изучения.

При методе отстаивания всю исследуемую порцию испражнений нужно размешать с водой и дать отстояться в стеклянном цилиндре, затем осторожно слить верхний слой жидкости.

Так повторяют несколько раз. После того, как жидкость станет прозрачной, ее сливают, а осадок просматривают в стеклянной ванночке или чашке Петри, как было указано выше.

Микроскопические методы.

Микроскопия - основной метод исследования испражнений для обнаружения яиц и личинок гельминтов. Испражнения для анализа должны быть доставлены не позже суток после их выделения. При нарушении этого правила диагноз поставить затруднительно или невозможно в связи с разрушением яиц и личинок. Для повышения достоверности исследования анализы нужно повторять несколько раз ежедневно или с промежутками в 1-3 дня.

Нативный мазок.

Небольшой кусочек испражнений переносят палочкой на предметное стекло в каплю 50% водного раствора глицерина (для его получения смешивают равное количество дистиллированной воды и глицерина) и растирают до получения равномерного прозрачного мазка. На одном стекле готовят два мазка.

При небольшом количестве яиц в испражнениях их не всегда удается выявить, поэтому применение только этого метода не является полноценным и достоверным.

Толстый мазок с целлофаном (метод Като).

Принцип метода: яйца гельминтов обнаруживают в толстом мазке испражнений, просветленном глицерином и подкрашенном малахитовой зеленью.

Предварительно гидрофильный целлофан, толщиной 22 мхм, нарезают пластинками с размером сторон 20x40 мм и погружают на сутки в раствор следующего состава: 6 мл 3% водного раствора малахитовой зелени, 500 мл глицерина и 500 мл 6% водного раствора фенола.3-5 мл указанной смеси достаточно для обработки 100 пластинок, которые затем можно хранить в этом же растворе в хорошо закрытом сосуде.

Ход исследования.

100 мг испражнений наносят на предметное стекло, покрывают обработанной, как описано выше, пластинкой целлофана и придавливают резиновой пробкой так, чтобы испражнения не растекались из-под целлофана.

Микроскопирование при малом или большом увеличении необходимо проводить не позже, чем через час после приготовления мазка, а в жаркую погоду - через 30-40 минут. Высыхание препарата и длительное просветляющее действие глицерина затрудняют микроскопирование.

Метод Като позволяет исследовать значительный объем испражнений и с большей эффективностью, чем при обычном нативном мазке. Этим методом можно выявить яйца аскариды, власоглава, лентеца, трематод, тениид.

Однако для выявления яиц анкилостомид и карликового цепня, особенно при малой интенсивности инвазии, метод Като недостаточно эффективен.

Метод закручивания по Шульману.2-3 г испражнений размешивают стеклянной палочкой круговыми движениями с трех-пятикратным количеством физиологического раствора, не касаясь стенок сосуда. Яйца и личинки гельминтов скапливаются в центре.

После окончания перемешивания каплю на конце палочки быстро переносят на предметное стекло, закрывают ее покровным стеклом и исследуют под микроскопом. Этим методом хорошо выявляются личинки гельминтов.

Методы обогащения.

Методы обогащения основаны на разности удельного веса яиц и применяемого солевого раствора, что позволяет обнаруживать небольшое их количество. Если удельный вес яиц больше удельного веса жидкости, то яйца концентрируются в осадке, который исследуют под микроскопом.

Этот метод осаждения (седиментации) применяют для яиц трематод. При большем удельном весе раствора яйца всплывают на поверхность жидкости, и тогда исследуют пленку. Это методы всплывания (флотации). Они наиболее эффективны для обнаружения яиц анкилостомид, власоглава и карликового цепня.

Метод Фюллеборна основан на всплывании яиц гельминтов в насыщенном растворе NaCl с высокой относительной плотностью. Для этого растворяют 400 г NaCl в 1 л воды при кипячении. Относительная плотность раствора 1,18-1,22. Раствор хранят в закрытой бутыли.

Для проведения анализа в банку объемом 30-50 мл помещают 2-3 г испражнений и при помешивании палочкой доливают почти доверху насыщенный раствор хлорида натрия. Полоской бумаги быстро удаляют всплывшие крупные частицы.

Через 45-60 мин. отстаивания проволочной петлей снимают поверхностную пленку и переносят ее на предметное стекло в каплю 50% водного раствора глицерина. Готовят несколько препаратов. Дополнительно просматривают 2-4 препарата из осадка, набирая его глазной пипеткой на 2 предметных стекла.

Необходимость исследования осадка обусловлена тем, что яйца трематод и тениид всплывают очень плохо и могут остаться в осадке. Хорошо всплывают яйца нематод (за исключением неоплодотворенных яиц аскарид), карликового цепня и лентеца.

К достоинствам этого метода относится его дешевизна и доступность к недостаткам - необходимость просмотра препаратов из поверхностной пленки и осадка, а также длительность отстаивания.

Метод Калантарян.

Вместо насыщенного раствора поваренной соли используют насыщенный раствор азотнокислого натрия (1 кг селитры заливают; литром дистиллированной воды и кипятят до полного растворения). Удельный вес раствора около 1,4.

Достоинства метода: быстро всплывают и обнаруживаются в поверхностной пленке яйца большинства гельминтов, что исключает необходимость исследования осадка. Не всплывают онкосферы тениид и яйца трематод, что следует учитывать при исследованиях с целью диагностики указанных гельминтозов. Высокая стоимость нитрата натрия ограничивает применение данного метода.

Метод Красильникова.

Под действием поверхностно-активных веществ, входящих а состав моющих средств (детергентов), яйца гельминтов освобождаются от испражнений и концентрируются в осадке.

Предварительно готовят 1% раствор стирального порошка "Лотос". Для этого высушивают порошок в сушильном шкафу при 100°С в течение 1-2 часов, затем 10 г порошка растворяют в 1 л водопроводной воды. При отсутствии "Лотоса" можно использовать и другие стиральные порошки, но каждого из них нужно брать столько, сколько растворится без образования осадка в 1 л водопроводной воды.

В стеклянный сосуд, емкостью 30-50 мл, наливают 20-30 мл раствора детергента, туда же помещают небольшую порцию испражнений и хорошо перемешивают.

Соотношение испражнений и раствора должно быть примерно 1: 20. Испражнения должны находиться в растворе не менее суток. За это время на дне образуется осадок из 2-3-х слоев. Нижний слой состоит из грубых тяжелых частиц, в среднем слое собираются яйца гельминтов, верхний слой представляет собой беловато-серые хлопья.

Пастеровской или глазной пипеткой набирают 2-3 капли жидкости из среднего слоя и переносят на предметное стекло. На одном стекле готовят 2 препарата, накрывают покровным стеклом и микроскопируют.

Метод Красильникова позволяет обнаружить яйца всех видов гельминтов, выделяемые с испражнениями.

Метод Горячева.

Метод Горячева (метод осаждения) используется для диагностики описторхоза. Удельный вес яиц описторха высок, поэтому они не всплывают в солевых растворах. В цилиндр диаметром 2-3 см наливают 70-100 мл насыщенного раствора хлорида натрия.

Отдельно тщательно размешивают 0,5 г испражнений в 20-25 мл воды и осторожно фильтруют через воронку с двумя слоями марли в цилиндр на солевой раствор, избегая перемешивания. Яйца описторхов медленно оседают на дно цилиндра.

Через 2-3 часа верхний слой с калом отсасывают пипеткой, а оставшийся солевой раствор оставляют стоять на 12-20 часов или центрифугируют. Осадок пипеткой переносят на предметное стекло, покрывают покровным стеклом и микроскопируют. Этот метод применим и для диагностики других трематодозов.

Метод липкой ленты.

Метод липкой ленты используется для диагностики энтеробиоза. Кусочек липкой прозрачной полиэтиленовой ленты длиной 4-5 см липким слоем прикладывают через анус к перианальным складкам, сразу же снимают и приклеивают на предметное стекло. Полученные таким образом препараты микроскопируют.

Преимущества этого метода перед соскобом с перианальных складок заключается в быстроте и возможности довольно долгого хранения препаратов.

Диагностика тканевых гельминтозов.

Для диагностики тканевых гельминтозов (трихинеллез, цистицеркоз и другие) применяются иммунологичекие методы исследования: реакция кольцепреципитапии, связывания комплемента, флюоресцирующих антител, преципитации в агаре и другие, с помощью которых обнаруживаются в сыворотке крови больных соответствующие антитела. Для диагностики трихинеллеза и филяриатозов применяются специальные методы исследований.

Метод биопсии мышц.

Метод биопсии мышц для диагностики трихинеллеза. Исследуют мышцы больного и остатки мяса животных, послуживших причиной заражения человека. Для анализа чаще берут кусочек (несколько граммов) дельтовидной или икроножной мышцы в асептических условиях.

Мышцу измельчают ножницами и помещают между двумя толстыми стеклами (компрессорий) слегка раздавливают и просматривают на малом увеличении микроскопа. Внутри мышечных волокон обнаруживаются спирально свернутые личинки трихинелл в округлых или лимонообразных капсулах.

Метод переваривания мышц.

Метод переваривания мышц для диагностики трихинеллеза более эффективным. Мелко нарезанные мышцы заливают искусственным желудочным соком (1% раствор пепсина в 0,7% растворе соляной кислоты) и помещают в термостат при 37°С на 12-16 часов.

Объем желудочного сока должен превышать навеску мышц с 15-20 раз. После переваривания на предметное стекло пипеткой переносят осадок и микроскопируют его. В осадке обнаруживаются свободные от капсул личинки трихинелл.

Метод мазка крови и толстой капли.

Данный метод применяется для диагностики фиряриатозов. Большинство видов микрофилярий локализованы в крови, поэтому для их обнаружения применяют исследование крови - мазок или толстую каплю.

Кровь берут в асептических условиях из пальца преимущественно ночью. Для приготовления мазка каплю крови помещают на предметное стекло и краем второго стекла размазывают ее по стеклу.

Мазок фиксируют метиловым спиртом и окрашивают по Романовскому-Гимза. Для приготовления толстой капли берут несколько капель крови на предметное стекло и углом другого стекла круговыми движениями размазывают ее до получения пятна, диаметром около 1,5 см.

После высушивания эритроциты гемолизируют дистиллированной водой и окрашивают по Романовскому-Гимза. Михрофиллярии выявляются в виде тонких извитых нитей, окрашенных в голубой цвет.

Таблица 1

ОТЛИЧИТЕЛЬНЫЕ ПРИЗНАКИ ЯИЦ ГЕЛЬМИНТОВ

№		Название гельминта		Отличительные признаки яиц
1		2		3
1		Фасциола		Трематоды Размеры около 153x80 мкм. Форма яйцевидная, правильная. Оболочка желтовато-коричневая, гладкая. На верхнем полюсе имеется крышечка. Это самое крупное яйцо гельминтов человека.
2		Описторх		Размеры 26-30x10-15 мкм. Яйцо овальной формы, несколько расширенное у нижнего полюса. На верхнем полюсе имеется крышечка. Оболочка желтого цвета.
3	Парагоним			Размеры 80-118x48-60 мкм. Форма овальная. На верхнем полюсе хорошо выражена крышечка. Оболочка золотисто-коричневая, толстая, гладкая.
4			Шистосома урогенитальная	Размеры 120-190x50-73 мкм. Форма веретенообразная, без крышечки. Острый шип на одном полюсе расположен вдоль продольной оси яйца. Оболочка тонкая, прозрачная.
5			Шистосома Менсона	Размеры 112-169x60-70 мкм. Форма овально-вытянутая. Острый крупный шип расположен на боковой поверхности яйца, слегка загнут. Оболочка толстая, желтая.
6			Шистосома японская	Размеры 75-90x53-74 мкм. Форма овальная. На боковой поверхности ближе к одному из полюсов расположен небольшой тупой шип. Оболочка бледно-желтая.
7			Тенииды (свиной и бычий цепни)	Цестоды Размеры 30-40x20-30 мкм. Форма округлая, реже слегка овальная. Оболочка толстая, двухконтурная, поперечно-исчерченная, прозрачная. Внутри расположена онкосфера.
8			Карликовый цепень	Размеры 40x50 мкм. Форма округлая или овальная. Оболочка двойная, прозрачная. Между оболочками имеются извивающиеся нити. Внутри различима лимонообразная онкосфера.
9			Лентец широкий	Размеры 68-71x40-45 мкм. Форма широкоовальная. Оболочка серого или желтоватого цвета, гладкая. На одном полюсе имеется крышечка, на другом - бугорок.
,0			Аскарида	Нематоды а) Оплодотворенные яйца. Размеры 50-70x40-50 мкм. Форма овальная, реже округлая. Оболочка толстая, многослойная, бугристая, темно-желтая. Внутри находится зародышевая клетка округлой формы. Между ней и полюсами имеется свободное пространство. б) Неоплодотворенные яйца. Размеры 50-80x40-50 мкм. Форма близкая к овальной. Оболочка толстая, многослойная, мелкобугристая с отдельными выступающими более крупными буграми темно-желтая. От полюса до полюса яйцо заполнено желточными клетками.
11			Власоглав	Размеры 50-55x23-32 мкм. Форма лимонообразная (боченкообразная). Оболочка толстая, гладкая, желто-коричневая. На полюсах имеются пробкообразные структуры.
12			Острица	Размеры 50-60x26-30 мкм. Форма овально-вытянутая, асимметричная (одна сторона выпуклая другая более плоская). Оболочка тонкая, гладкая, прозрачная, бесцветная.
13			Анкилосто-миды	Размеры 54-70x36-40 мкм. Форма овальная с притуплёнными полюсами. Оболочка тонкая, прозрачная, бесцветная.

Литература

1.    Петровский А.В. Паразитология, Мн.: Светач, 2007 г. 354 с.

2.    Аскерко А.Ч. Основы паразитологии Мн.: БГМУ, 2008 г. 140 с.

3.    Селявка А.А. Общая паразитология Мн.: Знание, 2007 г. 250 с.