Методика синтеза фосфатов кальция из модельных растворов, приближенных по электролитному составу внеклеточной жидкости

Глава 2. Экспериментальная часть

2.1 Методика синтеза фосфатов кальция из модельных растворов, приближенных по электролитному составу внеклеточной жидкости

В качестве прототипа внеклеточной жидкости был использован модельный раствор SBF (Simulated Body Fluid) (табл. 1).

Таблица 2

Концентрации ионов для приготовления растворов синтеза

Осаждение фосфатов кальция (рис. 7) проводится путем сливания растворов хлорида кальция (CaCl₂92H₂O), хлорида магния (MgCl₂96H₂O) двузамешенного фосфата калия (К₂HPO₄93H₂O), гидрокарбоната натрия (NaHCO₃), сульфата натрия (Na₂SO₄) и хлорида натрия (NaCl) с добавкой кремния в виде силиката натрия (Na₂SiO₃) либо тетраэтоксисилана (C₈H₂₀O₄Si). При проведении синтеза к 250 мл раствора, содержащему CaCl₂ и MgCl₂, приливают 250 мл раствора К₂HPO₄, NaHCO₃, Na₂SO₄ и NaCl с добавкой Na₂SiO₃ или C₈H₂₀O₄Si. Суммарный объем смеси составляет 500 мл. рН полученного раствора должно составлять 7.40 (с погрешностью корректировки кислотности ± 0.05) раствором HCl или NаОН (20 %). Время кристаллизации составляет 48 часов. После отстаивания раствор фильтруют с помощью водоструйного насоса, колбы Бунзена и воронки Бюхнера (через два фильтра синяя лента). Отбирают часть надосадочной жидкости для проведения химических анализов, измеряют рН равновесного раствора.. По окончании фильтрования осадок на фильтре промывают водой (V=50 мл), высушивают в сушильном шкафу при температуре ~ 100 °С до полного удаления воды.

Рис. 7. Схема модельного эксперимента in vitro

2.1.1 Методика осаждения и получения покрытия фосфатов кальция на образцах титана.

Для осаждения гидроксилапатита на поверхность титана марки ВТ1-0 (табл. 3), пластинки титана размером 15 мм*15 мм*1.2 мм были предварительно обработаны: отполированы; протравлены; пластинки, которые не подвергались механическому и химическому воздействию; мощным ионизационным пучком; лазерной абляцией; перфорированы (протравленные, не подвергавшиеся механическому и химическому воздействию, подвергшиеся лазерной абляции). На рис. 8 приведены фотографии образцов титановых пластин различной обработке.

Таблица 3

Состав и свойства сплава титана ВТ 1-0

а б

в г

д

Рис.8 Образцы титановых пластин различной обработки а) травленная; б) не подвергавшаяся химическому и механическому травлению; в) перфорированная травленная; г) перфорированная не подвергавшаяся химическому и механическому травлению; д) шлифованная обработанная МИП

После чего пластинки опускали в вертикальном положении в мерные конические колбы 25-50 мл, затем приливали прототип модельного раствора синовиальной жидкости человека (рис. 9) . Данную систему выдерживали в течение 10, 20 и 30 дней, после чего пластинки вынимали из модельного раствора, просушивали при комнатной температуре и анализировали с помощью оптической и растровой микроскопии.

Рис. 9 Метод осаждения кремний-замещенного гидроксилапатита

2.2. Определение химического состава надосадочной жидкости

2.2.1. Методика определения фосфат-ионов по молибденовой сини

[ГОСТ 18309–72.]

Сущность метода

Ортофосфат-ионы в присутствии избытка молибдата в кислой среде образуют фосфорномолибденовую гетерополикислоту (ФМК). Восстановлением ФМК получают «фосфорномолибденовую синь», обладающую интенсивной окраской, что является основой высокочувствительного фотометрического метода определения фосфора. Оптическая плотность полученного раствора пропорциональна концентрации фосфора в исходном растворе. Восстановление проводят в мягких условиях, чтобы исключить восстановление свободных ионов молибдата. В качестве восстановителя применяют гидразин-сульфат. Мешающее влияние силикат-ионов устраняют с помощью лимонной кислоты.

На приборе КФК-2, пользуясь красным светофильтром (λ_эфф = 690 нм) и кюветами с толщиной слоя 2 см. Определение повторяют трижды и по средним величинам оптических плотностей строят градуировочный график: D = f {С(РО₄^3-)}, рассчитывают уравнение регрессии.

Обработка результатов

Содержание ортофосфатов в растворе определяют по формуле:

, моль/л (10)

- концентрация фосфат-ионов в пробе, найденная по градуировочной зависимости, моль/л; V_ал- объем аликвоты пробы, взятой для анализа, мл.

Погрешность определений находится в пределах 2 – 4 отн. %.

2.2.2. Методика фотометрического определения концентрации кремния в виде желтой формы молибдокремниевой кислоты [20]

Сущность метода

Определение концентрации кремния фотометрическим методом основано на взаимодействии мономерно-димерной формы кремниевой кислоты и силикатов с молибдатом аммония в кислой среде с образованием молибдокремниевой гетерополикислоты желтого цвета.

Выполнение анализа

Измеряют оптическую плотность раствора на спектрофотометре при l = 410 нм (400 нм при измерении на фотометре, снабженном светофильтрами) в кюветах с толщиной слоя 2 см относительно холостой пробы, в качестве которой используют 25 мл дистиллированной воды со всеми реактивами, используемыми при подготовке серии стандартных градуировочных растворов.

Градуировочную зависимость оптической плотности от массовой концентрации кремния рассчитывают методом наименьших квадратов.

Обработка результатов

Концентрацию кремния С в моль/л, присутствующего в анализируемой пробе в виде мономерно-димерных форм, находят по формуле:

, моль/л (11)

- концентрация фосфат-ионов в пробе, найденная по градуировочной зависимости, моль/л; V_ал- объем аликвоты пробы, взятой для анализа, мл.

2.2.3. Методика определения ионов кальция с помощью ионселективного электрода

Сущность метода.

Определение концентрации ионов кальция в ходе исследования растворимости образцов синтетических ортофосфатов кальция проводят методом прямой потенциометрии с использованием ионоселективного электрода

Проведение измерений

Перед измерениями в анализируемом растворе электрод промывают дистиллированной водой и слегка просушивают фильтровальной бумагой. Измеряют потенциал в анализируемом растворе и по градуировочному графику определяют значение концентрации ионов Са²⁺.

2.2.4 Методика измерения поверхностного натяжения суспензии фосфата кальция сталагмометрически [ГОСТ 50097-92].

Определение поверхностного натяжения этим методом заключается в сравнении количества капель при истечении из сталагмометра исследуемой жидкости (n_x) и жидкости (n_ст) с известным поверхностным натяжением (s_ст). Значение поверхностного натяжения исследуемой жидкости рассчитывают по формуле:

s₁=s₀ (12)

где r_х и r_ст – плотность исследуемой и стандартной жидкостей (s_воды=72,75 мДж/м²).

2.2.5 Методика измерения краевого угла смачивания фосфата кальция титанового образца [60].

Для измерения краевого угла смачивания был использован метод базирующийся на измерении геометрических параметров капли жидкости (высоты и диаметра), которая смачивает поверхность. Предварительно поверхность титанового образца обезжиривали раствором этилового спирта, затем при помощи стеклянного капилляра диаметром порядка 0,2 мм наносили каплю, исследуемой суспензии. Измерение геометрических параметров капли производилось на оптическом микроскопе NEOPHOT 2 (рис.2), с использованием микрометрического винта имеющегося на данном микроскопе

Дальнейший расчет проводили по формуле:

(13)

2.2.6. Методика изучения растворимости ортофосфатов кальция

Для изучения устойчивости образцов ортофосфатов кальция, синтезированных в различных условиях, проводят их растворение в кислых и слабокислых растворах при постоянном перемешивании, контроле рН системы, концентрации ионов кальция и фосфат-ионов, переходящих в жидкую фазу.

Изучение растворимости образцов кремний-замещенного гидроксилапатита проводят в растворе соляной кислоты, значения рН для которых составляет 2, NaCl 0.9 %, а также трис-HCl буфер.

На аналитических весах на сухом часовом стекле берут навеску образца кремний-замещенного гидроксилапатита массой 0.1000 г. Изучение процесса растворения кремний-замещенного гидроксилапатита проводят при постоянном перемешивании раствора. Через определенные промежутки времени (τ = 0 - 40 мин) отмечают величину кислотности среды, значение показателя концентрации ионов кальция в системе. Через 40 мин от начала эксперимента отбирают пробу раствора для анализа на фосфат-ионы. Концентрацию фосфат-ионов в жидкой фазе определяют по методу «фосфорномолибденовой сини».

Алгоритм обработки экспериментальных данных [60]:

1) Рассчитывали степень растворения синтезированного фосфата кальция

(14)

где - степень растворения вещества.

2) Затем по полученным данным о растворимости фосфата кальция при одиннаковой степени растворения вещества, расчитывали энергию активациипо формуле:

(15)

Необходимо подчеркнуть, что и означают время, необходимое для достижения одного и того же значения степени растворения вещества в первом и втором опытах. Уравнение (8) показывает, что зависимость от выражается аппроксимирующей линией, тангенс угла наклона которой к оси абсцисс численно равен энергии активации Е/R. Вместо определения углового коэффициента прямой, энергию активации можно вычислить по формуле:

(16)

3) По экспериментальным данным строят зависимость от , где и отвечают равным значениям и . Из уравнений для скорости растворения при равных значениях следует соотношение:

(17)

2.3 Определение состава образцов

2.3.1.Методика анализа методом ИК-спектроскопии

С целью получения дополнительной информации о составе синтезированных образцов, использован метод инфракрасной спектроскопии (ИК-спектроскопии).

ИК-спектры получали на спектрофотометре «ФТ-801» (рис. 11). Прибор предназначен для регистрации в ближней и средней ИК-области спектров поглощения твердых, жидких и газообразных веществ с их последующей идентификацией, а также для качественного и количественного анализа смесей, содержащих несколько компонентов. Фурье-спектрометр «ФТ-801» имеет оригинальную оптическую схему интерферометра, «двойной кошачий глаз», простую, компактную и устойчивую к разъюстировкам. Прибор автоматизирован (используется цифровая электроника) и управляется компьютером (USB-интерфейс).

Рис.11 «ФТ-801» с набором приставок и принадлежностей

Образцы готовились методом прессования таблеток с КВr.. Запись спектра исследуемых образцов проводили в области от 4000 до 470 см^-1. Все спектры измеряли с общим числом сканирований равном 32. Программа «ZaIR 3.5» использовалась для получения, обработки и поиска инфракрасных спектров в базах данных, которые содержат более 130 тысяч спектров. Чувствительность метода ИК-спектроскопии для данных измерений составляет 5 %.

Степень кристалличности исследуемого образца оценивалась по величине параметра инфракрасного расщепления антисимметричного деформационного колебания ν₄ связи О-Р-О (спектральная область 500 – 650 см^-1), определяемого как отношение интенсивностей двух пиков к интенсивности «впадины» между ними [61]:

(14)

2.3.2 Методика рентгенофазового анализа

Рентгенофазовый анализ синтезированных фосфатов кальция проводился на рентгеновском дифрактометре ДРОН-3. Дифрактограммы получали «методом порошка». Съемка дифрактограмм проводилась в интервале 10 - 60 бреговских углов отражения по 2 Θ.

Из дифрактограмм определяли углы 2Θ брэгговских отражений и их относительную интенсивность. Качественный анализ фазового состава образца проводился путем сопоставления экспериментальных значений межплоскостных расстояний и относительных интенсивностей дифракционных максимумов с набором соответствующих значений для каждой из предполагаемых фаз в международной базе по данным порошковой дифрактометрии PDF-2. Предел обнаружения 0.5 - 5 масс. %.

Для образцов, представленных гидроксилапатитом, по дифрактограмме оценивали размеры кристаллитов по формуле Селякова-Шерера:

(15)

где D– размер кристаллита (Å), который оценивался по рефлексу [002], k – фактор формы, примерно равный 0.9, λ – длина волны, применяемая для анализа (1.54056), β_m – физическое уширение линии образца, обусловленное малыми размерами кристаллитов (ширина пика на половине высоты или интегральная ширина, выражается в радианах и определяется по дифрактограмме образца), θ – угол дифракции (θ=12.92).

2.3.3 Методика изучения морфологии частиц твердой фазы

методом оптической микроскопии

Осадки, полученные в ходе синтезов, исследуют методом оптической микроскопии с помощью микроскопа МБР-1 при 120-ти кратном общем увеличении (увеличение окуляра ×15, увеличение объектива ×8) (рис. 13).

Рис. 13. Внешний вид микроскопа МБР-1

1 - основание (штатив); 2 - микрометрический винт*; 3 - макрометрический винт; 4 - винты, перемещающие столик; 5 - предметный столик; 6 - тубусодержатель; 7 - окуляр; 8 - тубус; 9 - револьвер; 10 - объективы; 11 - отверстие предметного столика;

12-конденсор; 13 - диафрагма; 14 - винт конденсора; 15 – зеркало

Для фотографирования образцов возможно использование цифрового фотоаппарата любой марки. При этом объектив фотоаппарата помещают вплотную к окуляру микроскопа, таким образом, чтобы добиться точного совпадения изображения, наблюдаемого в окуляре, с фиксируемым фотоаппаратом. Съемку проводят в режиме оптимальном для получения четких контрастных снимков.

2.4 Методика термогравиметрического анализа

Сущность метода.

Определение массы кремний-замещенного гидроксиапатита после прокаливания в муфельной печи, на аналитических весах.

Проведение измерений

В сухие керамические тигли отбираются навески Si-ГА m=0.2000±0.0005 г. После чего данные образцы помещаются в муфельную печь на 2 часа. Температура прокаливания составляет от 200до 10000С с шагом в 2000С. По истечения времени тиглям дают остыть до комнатной температуры, а после проводят взвешивание на аналитических весах. Образцы переносят в специальную маркированную емкость и отправляют на физический анализ.