И. К. Проскурина, К. Е. Гусева, А. Е. Агапова
Исследования влияния различных химических соединений на биологические молекулы, в том числе на ферменты, весьма актуальны в настоящее время, поскольку они дают возможность выявить новые тест-функции для мониторинга окружающей среды.
Большое количество работ посвящено изучению влияния соединений тяжелых металлов на живые организмы растительного и животного происхождения [1, 8, 9, 12]. В меньшей степени в литературе представлены данные о влиянии органических соединений [8]. Целью данной работы явилось исследование влияния фенола и N,N'-диметилмочевины на активность катала-зы элодеи канадской, содержащейся в модельном водоеме.
Каталаза (КФ 1.11.1.7) - весьма распространенный фермент, она находится почти во всех аэробно дышащих клетках и у некоторых факультативных анаэробов. Функция каталазы заключается в защите организма от активных кислородсодержащих радикалов и пероксида водорода [5,7]. Активность каталазы весьма различна не только в разных организмах одного и того же вида или разновидности, но и у одного и того же организма в различных его органах в зависимости от возраста или стадии развития, от физиологического состояния и от многих других причин. Исследования показали, что отклонения от среднестатистического значения в активности каталазы могут доходить до 250%. Эти данные показывают, с какой осторожностью надлежит относиться к выводам об активности каталазы в зависимости от вида и рода живого организма или от внешнего воздействия [7]. Вот почему исследования влияния каких-либо токсикантов на активность каталазы целесообразно проводить в модельной экосистеме, это позволит исключить влияние других факторов
на активность исследуемого фермента и перенести полученные результаты на естественные водоемы. Моделирование экологических процессов и проведение эколого-биохими-ческих исследований включает в себя разработку моделей для понимания, предсказания и оценки нынешних и вероятных будущих воздействий и реагирования экосистем на множество стрессов на разных уровнях. Модельная экосистема позволяет имитировать поведение системы или ее компонентов при заданных условиях, не прибегая к проведению эксперимента над всей системой и обеспечивая сохранение внешних условий, близких к естественным, а также позволяет формировать требуемые начальные и текущие условия эксперимента и эффективный контроль в течение заданного промежутка времени [3, 6, 13]. Созданная нами модель водной экосистемы включает элементы концептуальной и имитационных моделей. Имитационные модели - это уменьшенные копии отдельных подсистем; концептуальные модели представляют собой блоковые схемы воздействия тех или иных подсистем в пределах более широких систем. Каждая модель должна иметь постоянные факторы и ряд переменных. Для модели водной экосистемы такими переменными могут быть объем воды, концентрация кислорода, температура и рН воды, количество водных организмов, содержание химических соединений. Предпочтительно, чтобы модель включала 2 переменных фактора. Используемая в нашем эксперименте модель включает следующие факторы: а) постоянные -общий объем воды (9 л), прозрачность воды, количество и состав грунта (0,5 кг), температурный режим (18-19 °С), освещенность, количество растений;
б) переменные - концентрация токсиканта - фенола или N,N'-диметил-мочевины, время воздействия токсиканта. Важной составляющей в работе с биологическими моделями является статистический метод обработки полученных данных, так как исследователь всегда имеет дело с конкретной особью, у которой видовые качества в какой-то мере маскируются индивидуальными особенностями, связанными с его функциональными свойствами, - это индивидуальные отклонения в ту или иную сторону от «видового усреднения». Поэтому для исключения индивидуальных отклонений и выявления общих закономерностей все эксперименты были выполнены в 3-х биологических и 5-7 аналитических последовательностях.
Методы исследованияВ качестве исходного материала для исследований использовался экстракт стеблей и листьев элодеи канадской, взятой из прудов Петропавловского парка г. Ярославля. Экстракт приготовляли путем гомогенизации 0,5 г листьев и стеблей элодеи с небольшим количеством кварца и дистиллированной воды. Затем полученную массу переносили в мерную колбу на 25 мл и доводили до метки дистиллированной водой. Экстракт немедленно фильтровали и использовали для исследований.
Активность каталазы определяли колориметрическим методом [4]. Принцип метода основан на способности перокси-да водорода образовывать с солями молибдена стойкий окрашенный комплекс. В опыте использовались холостая, контрольная и опытная пробы. В каждую пробу вносили 1 мл трис-HCl буфера рН=7,8, в холостую и опытные - по 2 мл пероксида водорода, а в контрольную - 2 мл дистиллированной воды; в контрольную и опытные пробы затем прибавляли по 0,1 мл экстракта элодеи канадской. Реакцию останавливали через 10 минут добавлением 1 мл 4%-ного раствора мо-либдата аммония во все пробирки, после этого в холостую пробу приливали 0,1 мл экстракта. Интенсивность окраски в каждой пробе измеряли на ФЭКе при длине волны 410 нм против контрольной пробы. Активность каталазы рассчитывали по формуле:
Е = (А хол - А оп)*V*t*K, где Е - активность каталазы (мкат/мл); Ахол и Аоп - экстинкция холостой и опытной проб;
V - (0,1 мл) объем вносимой пробы; t - время инкубации;
К - коэффициент миллимолярной экс-тинкции Н2О2 (22,2 * 103 мМ-1*см-1) В эксперименте использовались различные концентрации токсикантов: фенола -1, 5, 10, 20 ПДК - [1 ПДК = 0,001 мг/л]; N,N'- диметилмочевины - 1, 5, 10, 20 ПДК (по данным ПДК мочевины) - [1 ПДК = 0,001 мг/л]. Выбор концентрации токсикантов не был случайным. Онова-нием служили данные ГорСЭС 2001 г. по содержанию фенола в реке Волга (3 ПДК) и в реке Которосль (6 ПДК) в черте города.
Результаты исследованийИсследования проводились в период май-июнь и сентябрь-ноябрь 2000-2002 гг. Определение активности каталазы элодеи канадской в отсутствии токсиканта показало сезонные изменения: так, в летний период активность составляла 22200±890 мкат/мл., а в осенний - 33300±2000 мкат/мл., то есть осенью активность каталазы на 30% выше. Вероятно, повышение активности каталазы в осенний период связано с накоплением за период вегетации перекисных соединений.
До изучения влияния токсикантов на активность каталазы интересно было исследовать изменение активности фермента во времени при содержании элодеи канадской в искусственном водоеме. Измерение активности проводили в течение 20 суток через каждые 2-е суток. Эти эксперименты показали, что активность исследованного фермента не изменяется на протяжении восьми суток, а затем плавно начинает расти (рис. 1). На 15-е сутки наблюдается увеличение активности в 1, 25 раза по сравнению с первыми сутками. Поэтому исследование влияния токсикантов проводили в течение восьми суток с тем, чтобы исключить естественные временные изменения активности каталазы.
Рис. 1. Сезонные изменения активности каталазы элодеи канадской (при содержании в чистом модельном водоеме)
Исследование влияние фенола в разных концентрациях на активность каталазы элодеи канадской (табл.1) показало, что активность исследуемого фермента не изменяется при воздействии токсиканта в концентрации 1 ПДК, что и следовало ожидать, так как ПДК - это предельно допустимая концентрация вещества, не оказывающая какого-либо вредного воздействия на организм. При воздействии фенола в концентрации 5 ПДК происходит незначительное падение активности каталазы на 2-е (18%) и 5-е (5%) сутки и снижение активности фермента (более 35%) на 8-е сутки содержания растения в загрязненном фенолом водоеме.
Резкие колебания активности каталазы наблюдаются при воздействии фенола в концентрации 10 ПДК. По истечении 2-х суток воздействия фенола активность каталазы падает почти в 2,5 раза, на 5-е сутки, напротив, увеличивается в 2 раза по сравнению с контролем, а на 8-е сутки вновь падает ниже значения контрольной пробы. Исследование воздействия фенола в концентрации 20 ПДК показало, что активность каталазы сначала возрастает на 20%, а потом постепенно падает. Такие изменения активности каталазы еще раз подтверждают данные о сложности взаимодействия фенола с растениями [2]. Как было ранее установлено [10, 11], фе-нольные соединения реагируют с растениями быстро, однако они химически неустойчивы и разлагаются в водной среде путем прямого окисления или с участием фенолоксидаз растительного происхождения. Промежуточные продукты окисления фенолов - хиноны - имеют высокую реакционную способность и могут рассматриваться как вторичные токсины.
В нашем исследовании, вероятно, на 5-е сутки воздействия фенола в концентрации 10 ПДК происходит накопление пе-рекисных соединений, что приводит к увеличению активности каталазы, дальнейшее содержание элодеи в загрязненном водоеме ведет к истощению резервов растения, что приводит к его гибели на 20-е сутки.
Таблица 1
Активность каталазы элодеи канадской при воздействии фенола
| Концентрация N,N'- диметилмо-чевины | Активность каталазы (мкат/л) при воздействии фенола | |||
| контроль | 2-е сутки | 5-е сутки | 8-е сутки | |
| 1ПДК | 22200±900 | 22200±900 | 22300+1000 | 22500±4000 |
| 5 ПДК | 22200±900 | 18200±1170 | 21300±760 | 14600±1300 |
| 10ПДК | 22200±900 | 9800±430 | 45730±900 | 20400±900 |
| 20ПДК | 22200±900 | 27000±1170 | 21000±700 | 19500±440 |
Результаты исследования активности каталазы элодеи канадской в случае загрязнения модельного водоема N,N'- диметилмочевины в концентрации 1, 5, 20 ПДК представлены в табл. 2.
Таблица 2
Активность каталазы элодеи канадской при воздействии N, N' - диметилмочевины
| Концентрация N,N'- диметилмочевины | Активность каталазы (мкат/мл) | |||
| контроль | 2-е сутки | 5-е сутки | 8-е сутки | |
| 1ПДК | 33300±750 | 33300±400 | 32200±400 | 33100±550 |
| 5 ПДК | 33300±750 | 31100±1400 | 16400±1200 | 14700±900 |
| юпдк | 33300±750 | 28100±1200 | 26600±1500 | 17300±1700 |
| 20ПДК | 33300±750 | 25700±900 | 22600±1500 | 11500±1200 |
Как видно из представленных данных, N,N'-диметилмочевина в концентрации 1 ПДК не оказывает влияния на активность исследуемого фермента (рис.2). При воздействии токсиканта в концентрации 5, 10 и 20 ПДК наблюдается понижение активности каталазы во времени. Такое падение активности фермента может быть вызвано двумя причинами: либо NN-диметилмочевина снижает синтез белка в элодее, либо продукты метаболизма токсиканта in vivo ингибируют каталазу.
Сравнивая результаты, полученные при загрязнении модельного водоема фенолом и N,N'-диметилмочевиной, можно констатировать, что выбранные токсиканты оказывают разное действие на активность каталазы элодеи канадской, что позволяет сделать заключение о разных механизмах воздействия выбранных токсикантов и их метаболитов на каталазу элодеи канадской.
Список литературы1. Будников Г.К. Тяжелые металлы в экологическом мониторинге водных систем // СОЖ. 1998. №5. С. 238.
2. Ганочкин Л.Д., Плеханов С.Е., Баттах М., Максимов В.Н. Адаптационно-токсикологические аспекты комбинированного действия фенола, меди и кадмия на зеленые микроводоросли // Вестник Московского университета, сер. Биология. 1995. №3. С. 41.
3. Гурман В.И., Дыхта Д.И. Эколого-экономические системы: модели, информация. Новосибирск: Наука, 1987. С. 80-123.
4. Королюк М.А., Иванова Л.И., Майорова Н.О., Токарев В.Е. Метод определения активности каталазы // Лабораторное дело. 1988. №1. С. 16.
5. Краткая химическая энциклопедия. М.: Советская энциклопедия, 1963. С. 455-456.
6. Мизинцев В.П. Применение моделей и методов моделирования в дидактике. М.: Знание, 1977. С. 4-7,26-31.
7. Михлин Д.М. Биохимия клеточного дыхания. М.: АН СССР, 1960. С. 246-260.
8. Пурмаль А.П. Антропогенная токсикация планеты // СОЖ, 1998. №9. С. 39-52.
9. Ровинский Ф.Я. Методы анализа загрязнения окружающей среды: токсичные металлы и радионуклиды. М.: Атомиздат, 1978. С. 85-112.
10. Роговин В.В., Муштакова В.М., Фомина В.А. Действие некоторых ксенобиотиков на зависимый от пе-роксидазы иммунитет растений // Известия РАН. 1996. №5. С. 613.
11. Стом Д.И. Фитотоксичность и механизмы детоксикации фенолов водными растениями / Автореф. дисс. ... д-ра хим. наук. Киев, 1982. С. 3-6, 13-28, 37-38.
12. Трахтенберг И.М. Тяжелые металлы во внешней среде. Минск: Наука и техника, 1994. 195 c.
13. Фиштейн Г.Н. Моделирование экосистем на основе одноклеточных организмов. М.: МГУ, 1983. С. 186-223.
14. Экологические исследования в управлении исследований и разработок агентства по охране окружающей среды США: обзор новых направлений // Проблемы окружающей среды и природных ресурсов. 2001. №12. С. 21
Похожие работы
... параметров жизнедеятельности высших и низших растений. Этот метод обладает рядом преимуществ, заключающихся в быстроте, разносторонности и высокой точности исследований. В частности, метод люминесцентной микроскопии позволяет быстрое выявление физиологического состояния клеток микроводорослей, что важно для изучения «цветения» водоёмов, определения качества водной среды. Постоянно возрастающая ...
... Глава II. Методики исследования загрязнения окружающей среды и оценки ее качества Для выполнения задач и достижения цели были разработаны нами методики исследования комплексной эколого-геохимической оценки урболандшафтов Волгоградской агломерации, которая заключается в исследовании почв, растительности, оценки выбросов промышленных предприятий и влияния ОС на здоровье человека. 2.1 ...
... нефти, изученный на разных уровнях - от общих физико-химических свойств до молекулярных реакций - был положен в основу разработанной методологии исследования органического вещества нефтезагрязненных геосистем и применен при идентификации источников углеводородного загрязнения водозабора "Усолка". Присутствие нефтепродуктов в составе аквабитумоидов поверхностных и подземных вод водозабора ...
... токсикорезистентности, связанные с неравномерным характером рассеяния элементов в земной коре и наличием биогеохимических провинций, представляют важный комплекс факторов, обусловливающих устойчивость пресноводных экосистем к антропогенному загрязнению поллютантами, являющимися одновременно природными компонентами водной среды. Вовлечение в биогенную миграцию химических элементов в определенных ...
0 комментариев