Нуклеиновые кислоты

Содержание

1.         История открытия и названия нуклеиновых кислот

2.         Нахождение нуклеиновых кислот в природе

3.         Получение нуклеиновых кислот

4.         Химические свойства нуклеиновых кислот

5.         Применение нуклеиновых кислот

6.         Занимательные факты о нуклеиновых кислотах

1. История открытия нуклеинов и их названия

Открытие нуклеиновых кислот связано с именем молодого врача из города Базеля (Швейцария) Фридриха Мишера. После окончания медицинского факультета Мишер был послан для усовершенствования и работы над диссертацией в Тюбинген (Германия) в физиолого-химическую лабораторию, возглавляемую Ф. Гоппе-Зейлером. Тюбингенская лаборатория в то время была известна ученому миру. Пройдя практику по органической химии, Мишер приступил к работе в биохимической лаборатории. Ему было поручено заняться изучением химического состава гноя. Молодой ученый не возражал против предложенной темы, так как считал лейкоциты, присутствующие в гное, одними из самых простых клеток.

Путём многочисленных опытов он получил из гнойных клеток вещество ядерного происхождения. Мишер был уверен именно в ядерном его источнике. Поэтому он начал более тщательное выделение ядер. В то время еще никто в биохимических лабораториях не пытался выделить ядра или какие-либо другие субклеточные компоненты, так что и здесь он был пионером.

Продолжив дальше очищать ядро от других клеточных фрагментов, он получил странное вещетво. Оно не разлагалось протеолитическими ферментами, значит, не являлось белком. Отсутствие растворимости в горячем спирте указывало на то, что это вещество не являлось и фосфолипидом. По-видимому, оно относилось к новому классу биохимических соединений.

Но Мишер с большой горячностью настаивал на точности своих результатов и добивался разрешения опубликовать их в печати. Тогда Гоппе-Зейлер решил проверить данные Мишера лично. Он и два его ассистента (одним из них был русский химик Любавин) в течение года шаг за шагом прошли все этапы аналитической работы Мишера и полностью подтвердили его данные, выделив нуклеин из клеток крови и из дрожжей.

В 1871 г. работа Мишера вместе с подтверждающими ее контрольными работами Гоппе-Зейлера и его ассистентов увидела свет. Существование нуклеина как специфического ядерного вещества стало научным фактом. Вскоре методика Мишера была применена для выделения нуклеина из различных тканей.

Термин «нуклеиновые кислоты» был предложен в 1889: нуклеиновыми они были названы потому, что впервые были открыты в ядрах клеток, а кислотами — из-за наличия в их составе остатков фосфорной кислоты. Позже было показано, что нуклеиновые кислоты построены из большого числа нуклеотидов (от нескольких десятков до сотен миллионов). В состав каждого нуклеотида входит азотистое основание, углевод (пентоза) и фосфорная кислота.

2. Нахождение нуклеиновых кислот в природе

Нуклеиновые кислоты в природе встречаются во всех живых клетках. Живые клетки, за исключением сперматозоидов, в норме содержат значительно больше рибонуклеиновой, чем дезоксирибонуклеиновой кислоты. На методы выделения дезоксирибонуклеиновых кислот оказало большое влияние то обстоятельство, что, тогда как рибонуклеопротеиды и рибонуклеиновые кислоты растворимы в разбавленном (0,15 М) растворе хлористого натрия, дезоксирибонуклеопротеидные комплексы фактически в нем нерастворимы.

Поэтому гомогенизированный орган или организм тщательно промывают разбавленным солевым раствором, из остатка с помощью крепкого солевого раствора экстрагируют дезоксирибонуклеиновую кислоту, которую осаждают затем добавлением этанола.

В клетках эукариот (например, животных или растений) ДНК находится в ядре клетки в составе хромосом, а также в некоторых клеточных органоидах (митохондриях и пластидах). В клетках прокариотических организмов (бактерий и архей) кольцевая или линейная молекула ДНК, так называемый нуклеотид, прикреплена изнутри к клеточной мембране. У них и у низших эукариот (например, дрожжей) встречаются также небольшие автономные, преимущественно кольцевые молекулы ДНК, называемые плазмидами. Кроме того, одно- или двухцепочечные молекулы ДНК могут образовывать геном ДНК-содержащих вирусов.

3. Получение нуклеиновых кислот

В клетках нуклеиновые кислоты связаны с белками, образуя нуклеопротеиды. Выделение нуклеиновых кислот сводится к очистке их от белков. Для этого препараты, содержащие нуклеиновые кислоты, обрабатывают ПАВ и экстрагируют белки фенолом. Послед, очистка и фракционирование нуклеиновых кислот проводятся с помощью ультрацентрифугирования, различных видов жидкостной хроматографии и гель - электрофореза. Для получения индивидуальных нуклеиновых кислот обычно используют различные варианты последнего метода.

Современные методы химического синтеза нуклеиновых кислот позволяют получать крупные фрагменты ДНК, в том числе целые гены. Методические основы химически - ферментативных методов синтеза ДНК разработаны X. Кораной.

Они включают:

Ø   химический синтез комплементарных, взаимоперекрывающихся олигонуклеотидов, из которых затем в результате комплементационных взаимодействий выстраиваются дуплексы - фрагменты молекулы синтезируемой ДНК с несовпадающими разрывами в обеих цепях;

Ø   соединение (лигирование) таких олигонуклеотидов в составе дуплекса с помощью фермента Т4 ДНК-лигазы. Сборку протяженных ДНК из синтетически однотяжевых олигонуклеотидов проводят в несколько этапов. Сначала собирают небольшие дуплексы с "липкими" концами (однотяжевыми комплементарными участками), из которых затем последовательно формируют более протяженные структуры. Таким образом могут быть получены искусственные фрагменты ДНК большой длины и с любой нуклеотидной последовательностью. С помощью генетической инженерии возможно клонирование (получение в индивидуальном виде и размножение) искусственных ДНК.

Несмотря на малую эффективность этого метода, были синтезированы олигонуклеотиды, содержащие до 16 звеньев, из которых были собраны первые синтетические гены. Фосфодиэфирный метод образования межнуклеотидных связей, использованный Кораной, имеет историческое значение. Однако разработанные им приемы введения и избирательные удаления защитных групп широко используются в других методах синтеза нуклеиновых кислот.

Важным шагом в совершенствовании синтеза олигонуклеотидов явилась разработка так называемого фосфотриэфирного метода. Образующийся динуклеотид после частичного деблокирования фосфата конденсируют аналогичным образом с другими динуклеотидом и т.д. Применение этого способа, в котором используют защиту фосфатной группы, позволило значительно сократить время синтеза и повысить выходы олигонуклеотидов.

Параллельно этим методам, которые осуществляют в растворах, разрабатывались твердофазные способы синтеза нуклеиновых кислот. В последнем случае процесс проводят в двухфазной системе; нуклеозидный компонент связан ковалентно с нерастворимым полимером, а нуклеотидный компонент и необходимые реагенты находятся в растворе.

Обычно в этом случае на первой стадии нуклеозид присоединяют с помощью "якорной" группы к нерастворимому полимеру. Затем его 5'-гидроксильную группу деблокируют и конденсируют с нуклеотидным компонентом. У образующегося полностью защищенного динуклеозидмонофосфата деблокируют защитную группу в положении 5' и присоединяют следующему нуклеотид и т.д.

Наиболее распространенные методы твердофазного синтеза олигонуклеотидов основаны на использовании нуклеотидного компонента, содержащего Р(III). В так называемом амидофосфитном способе нуклеотидным компонентом является эфир 3'-амидофосфита дезоксинуклеозида. Достаточно устойчивые амидофосфиты при протонировании в присутствии тетразола превращаются в сильные фосфорилирующие агенты. После завершения синтеза удаляют защитные группы с межнуклеотидных фосфатов, отделяют олигонуклеотид от носителя, деблокируют группы NH2 гетероциклов. Липофильную группу (МеО)2Тr удаляют после первого хроматографического разделения.

Стандартность операций в твердофазном синтезе олигонуклеотидов явилась основой для автоматизации процесса. Принцип работы автомата-синтезатора основан на подаче в реактор с помощью насоса (под контролем микропроцессора) защищенных нуклеотидных компонентов реагентов и растворителей по заданной программе в колонку, содержащую полимерный носитель с закрепленным на нем первым нуклеозидом. После окончания синтеза и отделения полностью защищенного олигонуклеотида от полимерного носителя проводят деблокирование, очистку и анализ синтезированных фрагментов ДНК. Так, с помощью гидрофосфорильного метода в автомате - синтезаторе за несколько часов получают 30-40-звенные олигонуклеотиды; возможен синтез более чем 100-звенных фрагментов ДНК. Разработаны синтезаторы, позволяющие проводить одновременно синтез несколько олигонуклеотидов.

Синтез олигорибонуклеотидов ферментативным путем осуществляют обычно с использованием рибонуклеаз или полинуклеотидфосфорилаз.

В качестве нуклеотидного и нуклеозидного компонента применяют мономеры или олигонуклеотиды. Эту реакцию используют для синтеза ди-, три- и тетрарибонуклеотидов. При увеличении длины олигорибонуклеотида начинает преобладать обратная реакция (гидролиз олигонуклеотида).

Химический синтез олигорибонуклеотидов проводят в основном с использованием тех же приемов, как и при синтезе ДНК.