Властивості кальційактивованих та АТФ–індукованих калієвих струмів мембрани міоцитів taenia caeci морської свинки

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ ІМ. О.О. БОГОМОЛЬЦЯ

НЕСІН ВАСИЛЬ ВАСИЛЬОВИЧ

УДК 577.352:612.73

 

ВЛАСТИВОСТІ КАЛЬЦІЙАКТИВОВАНИХ ТА

АТФ – ІНДУКОВАНИХ КАЛІЄВИХ СТРУМІВ МЕМБРАНИ МІОЦИТІВ ТAENIA CAECI МОРСЬКОЇ СВИНКИ

03.00.02 - біофізика

Автореферат дисертації

на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

КИЇВ – 2008

Дисертацією є рукопис

Роботу виконано у відділі нервово-м’язової фізіології Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України

Науковий керівник: академік НАН України, доктор медичних наук професор Шуба Михайло Федорович зав. відділом нервово-м’язової фізіології Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України

 

Офіційні опоненти: доктор медичних наук, професор Соловйов Анатолій Іванович головний науковий співробітник Інституту фармакології та токсикології АМН України;

доктор біологічних наук, професор Мірошниченко Микола Степанович зав. кафедри біофізики, біологічного факультету Київського національного університету ім. Тараса Шевченка

Захист відбудеться “5” лютого 2008 р. о 14⁰⁰ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д-26.198.01 при Інституті фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України за адресою: 01024, м. Київ, вул. Богомольця, 4.

З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України за адресою: 01024, м. Київ, вул. Богомольця, 4.

Автореферат розісланий “5” січня 2008 р.

Вчений секретар Спеціалізованої вченої ради, доктор біологічних наук З.О. Сорокіна-Маріна

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Основні функції кишечнику тісно пов’язані з його моторикою (сегментарне скорочення та перистальтичні хвилі), і забезпечується узгодженою роботою гладеньких м’язів поздовжнього та кільцевого шару стінки кишки. Моторна функція кишечнику надзвичайно важлива для процесів травлення та всмоктування поживних речовин. Вона забезпечує підвищення внутрішньокишкового тиску, що сприяє фільтрації розчинів з порожнини кишечнику до крові і лімфи та переміщення залишків хімуса за рахунок перистальтики по кишечнику. При багатьох патологічних процесах в травній системі відбувається порушення транзиту вмісту кишечнику. Ці порушення виступають головними причинами виникнення таких ускладнень, як післяопераційні парези, метеоризм, абдомінальний біль та запори. Тому гладенькі м’язи кишечнику є одним із важливих об’єктів дослідження фундаментальної та прикладної науки.

Питання, що стосуються механізмів регуляції тонусу, скорочення та розслаблення гладеньких м’язів з боку вегетативної нервової системи, були і залишаються центральними для фізіології, біофізики та фармакології м’язів. Одним з медіаторів гальмування інтестинальних гладеньких м’язів є аденозин-5’-трифосфат (АТФ), який викликає гіперполяризацію мембрани гладеньком’язових клітин (ГМК), пригнічення спонтанної активності і, як наслідок, розслаблення м’язів (Burnstock et al. 1963). Вперше пуринергічне гальмування вдалося заблокувати апаміном (токсин з отрути бджоли) у відділі Шуби М.Ф. (Владимирова, Шуба 1978). Пізніше в лабораторії Барнстока було показано, що апамін блокує калієву провідність мембрани (Banks et al. 1978). Вважається, що пуринергічне гальмування опосередковане активацією метаботропних пуринорецепторів (P2Y) і центральною ланкою цього гальмування є підвищення рівня внутрішньоклітинного кальцію за рахунок вивільнення його з внутрішньоклітинного інозитолтрифосфатного (IP₃) кальцієвого депо та наступною активацією кальційзалежних калієвих каналів малої провідності (SK) (Sanders et al. 1996).

Питання про типи кальційзалежних калієвих каналів (К_Са) в мембрані цих клітин та можливої їх участі у пуринергічному гальмуванні залишається відкритим. Тому значний науковий інтерес викликає виділення компонентів кальційзалежного калієвого струму (І_К(Ca)) із сумарного трансмембранного іонного струму, дослідження їх фармако–біофізичних характеристик, а також визначення їх внеску у процеси пуринергічного гальмування гладеньких м’язів шлунково–кишкового тракту (ШКТ).

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана в рамках наукових програм відділу нервово-м’язової фізіології Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України: “Механізми метаболічної регуляції іонних каналів та скорочення гладеньком’язових клітин”(№ держ. реєстрації 0198U001935), “Мембранні та внутрішньоклітинні механізми регуляції скорочення і активності іонних каналів гладеньком’язових клітин нейромедіаторами”(№ держ. реєстрації 0101U002636) та “Мембранні та метаболічні механізми збуджувальної та гальмівної дії нейромедіаторів на гладенькі м’язи”(№ держ. реєстрації 0105U003235).

Мета та завдання дослідження. Метою даної роботи було виділення компонентів сумарного кальційзалежного калієвого струму і визначення їх внеску в пуринергічне гальмування кишечнику. Для досягнення цієї мети були поставлені наступні завдання:

1.   Розробити методику виділення функціонально повноцінних ізольованих гладеньком’язових клітин taenia caeci морської свинки із застосуванням антиоксидантних речовин.

2.   Дослідити властивості кальційзалежного калієвого струму мембрани гладеньком’язових клітин taenia caeci морської свинки, розділивши його на компоненти за допомогою паксиліну, ТЕА та d-тубокурарину,

3.   Дослідити дію блокаторів кальційзалежних калієвих каналів (d-тубокурарину, паксиліну та ТЕА) на спонтанні вихідні струми.

4.   Визначити компоненти кальційзалежного калієвого струму мембрани міоцитів при активації пуринорецепторів.

Наукова новизна роботи. За допомогою методу фіксації потенціалу в конфігурації “whole-cell patch-clamp” було проведено розділення на компоненти інтегральних калієвих струмів та вивчення їх біофізичних та фармакологічних характеристик. Вперше виявлено блокуючу дію відомого нейротоксина d-тубокурарину на трансмембранні іонні струми та кальційзалежні калієві струми поодиноких свіжоізольованих ГМК кишечнику. Показано, що вихідні інтегральні трансмембранні іонні струми мають три складові: потенціалзалежний струм «затриманого випрямлення» та два компоненти І_К(Ca): І_К(Ca), що переноситься через SK канали та блокується d-тубокурарином і І_К(Ca), що переноситься через К_Са канали великої провідності (BK) чутливі до дії паксиліну та ТЕА. Показано, що спонтанні вихідні струми (СВС) за своїми ознаками та чутливістю до блокаторів можна розділити на струми малої та великої амплітуди. СВС малої амплітуди чутливі до блокуючої дії d-тубокурарину і обумовлені активацією SК каналів, а СВС великої амплітуди блокуються паксиліном і ТЕА та формуються за рахунок активації BК каналів.

Дослідження клітинних механізмів пуринергічного гальмування показало, що основна роль належить активації кальційзалежних калієвих каналів малої провідності, внаслідок вивільнення Са²⁺ із інозитолтрифосфатчутливого кальцієвого депо саркоплазматичного ретикулуму.

Теоретичне та практичне значення роботи. Представлена робота має як фундаментальне так і практичне значення, оскільки значно поглиблює та розширює сучасні уявлення про клітинні механізми гальмування в гладеньких м’язах. В роботі проведено розділення вихідного трансмембранного іонного струму на потенціалзалежний та кальційзалежний компоненти, досліджено фармако−біофізичні характеристики кальційзалежних калієвих струмів. Виявлено клітинні механізми регуляції кальційзалежних калієвих каналів, при активації метаботропних пуринорецепторів. Результати досліджень можуть бути використані біофізиками, фізіологами та фармакологами для створення нових засобів корекції розладів ШКТ.

Особистий внесок. Всі електрофізіологічні дослідження вихідного інтегрального трансмембранного іонного струму та його компонент, спонтанних вихідних струмів, описаних в роботі, а також отримання функціонально повноцінних поодиноких ГМК, обробка експериментального матеріалу були виконані особисто автором. Аналіз та узагальнення результатів досліджень були обговорені з науковим керівником та співавторами публікацій.

Апробація роботи. Основні положення роботи доповідались на семінарах відділу нервово−м’язової фізіології та поточних наукових семінарах Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України (2002-2007), на міжнародній спеціалізованій школі нейронаук IBRO “Рецептори, канали, месенджери” (Ялта, 2004), Міжнародній науковій конференції “Клітинні і субклітинні механізми функціонування травної системи” (Львів, 2004), І Українській науковій конференції “Проблеми біологічної і медичної фізики ” (Харків, 2004), Міжнародній науковій конференції “Механізми функціонування фізіологічних систем”, (Львів, 2006), 4 з’їзді Українського біофізичного товариства (Донецьк, 2006).

Публікації. Матеріали дисертації опубліковані в п’яти наукових статтях і п’яти тезах доповідей в матеріалах наукових зібрань.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, опису методики досліджень, результатів досліджень, їх обговорення, висновків та списку використаних джерел із 175 найменувань. Робота викладена на 111 сторінках (без списку літератури), ілюстрована 39 рисунками та 2 таблицями.

МЕТОДИКА ДОСЛІДЖЕНЬ

Дослідження було проведено на свіжоізольованих поодиноких ГМК поздовжнього м’язового шару сліпої кишки (taenia cаесi) морської свинки. Для виділення клітин шматочки taenia cаесi поміщали до 2 мл номінально безкальцієвого розчину, що містив 3 мг колагенази (тип IА), 2 мг бичачого сироваткового альбуміну, 2 мг соєвого інгібітору трипсину та 2 мг таурину (поглинач вільних радикалів) на 25 - 35 хв. при 34 ^оС. Оброблені таким чином шматочки taenia cаесi відмивалися від ферменту і багаторазово пропускалися через пастерівську піпетку в номінально безкальцієвому розчині.

В основній частині експериментів для дослідження іонних струмів ізольованих ГМК застосовувалась “whole-cell” конфігурація методу “patch-clamp” (Hamill et al. 1981). Мікропіпетки виготовляли з м’якого молібденового скла, після заповнення розчином вони мали опір 2 - 4 МОм. Зовнішній розчин мав наступний склад (мМ): NaCl 120.4; КCl 5.9; CaCl₂ 2.5; MgCl₂ 1.2; d-глюкоза 11,5; HEPES 5; pH 7.4 (NaOH). Піпетковий розчин мав такий склад (мМ): КCl 135; MgSO₄ 1; Na₂ATФ 2; ЕГТА 0.3; HEPES 10; pH 7.3 (КOH). Внутрішньоклітинна концентрація вільного Са²⁺ ([Ca²⁺]_i) при використанні останнього розчину була близькою до фізіологічної і становила приблизно 100 нМ. При дослідженні Са²⁺ струму (I_Ca) іони К⁺ в розчинах еквімолярно замінювались на Cs⁺, також до зовнішнього розчину додавали 5 мМ тетраетиламонію (ТЕА). Експерименти проводились при кімнатній температурі (22-24 ^oC).

Реєстрація іонних струмів проводилась за допомогою підсилювача “L/M ЕРС-5”. Сигнал з виходу перетворювача струм - напруга надходив через фільтр низьких частот (частота зрізу 1 кГц) на аналого-цифровий перетворювач і далі в комп’ютер ІВМ РС/АТ. Дані аналізувались за допомогою програм “pCLAMP 5.5” та “Origin 5.0”.

Значення величин вказані як: середнє арифметичне ± стандартна похибка середнього арифметичного. В скобках вказано кількість клітин. Дані порівнювали за допомогою парного двохстороннього t-тест Стьюдента. Відмінності вважали статистично достовірними при значенні Р<0.05.

Результати дослiджень. Загальна характеристика Са²⁺залежних К⁺ струмів гладеньком’язових клітин taenia cаесі морської свинки. Для розділення та вивчення характеристик компонент І_К(Са), було використано неселективний блокатор К⁺ каналів – ТЕА, та відомий блокатор ВК каналів великої провідності – паксилін. В якості блокатора SK каналів було використано відомий нейромодулятор d-тубокурарин (d-ТК). Трансмембранні струми викликались за допомогою ступінчастих зміщень мембранного потенціалу від підтримуваного рівня – 60 мВ, що наближується до фізіологічного потенціалу спокою цих клітин. Типові значення вхідного опору клітин, що використовувались в наших експериментах, складали 1 - 2 ГОм. В досліджуваних клітинах при ступінчатих деполяризуючих зміщеннях мембранного потенціалу від підтримуваного потенціалу –60 мВ тривалістю 250 мс, виникав вихідний струм з порогом активації –30 мВ. Аплікація паксиліну за таких експериментальних умов викликала значне пригнічення вихідного струму, також знижувались його осциляції. На рис. 1 показана дія паксиліну (100 нМ) на трансмембранний іонний струм. На цьому ж рисунку подана динаміка дії паксиліну на амплітуду вихідного струму. Ефект паксиліну досягав максимуму протягом 2 – 3 хвилин від початку його аплікації. Постійна часу дії паксиліну складала 1,3 ± 0,3 хв (n=5). Відновлення амплітуди вихідного струму при відмиванні токсину відбувалось з постійною часу 0,9 ± 0,1 хв (n=5).

На рисунку 2 показано вольт-амперну характеристику (ВАХ) паксилінчутливого І_К(Са), що переноситься через ВК канали, отриманого шляхом відніманням значень струму при дії блокатора від контрольних значень.

На ВАХ паксилінчутливого І_К(Са) (рис. 2.А) спостерігається зміна крутизни “перегин” в районі максимуму активації І_Са, що дає змогу казати про залежність, цього струму від концентрації іонів Са²⁺ в середині клітини. Крім того, канали, через які переноситься паксилінчутливий І_К(Са), проявляли потенціалзалежні властивості. Зі збільшенням рівня деполяризації спостерігалось збільшення його амплітуди, незважаючи на зменшення входу Са²⁺ в клітини при потенціалах +20…+40 мВ. На рисунку 2.Б показано криві нормалізованої провідності вихідного струму. Половина максимальної активації V_0,5 в контролі складала 32.6±1.2 мВ, а коефіцієнт крутизни становив 12±0.7 мВ. При дії паксиліну ці значення становили 19.1± 0.9 мВ та 15± 0.6 мВ відповідно (n=7).

ТЕА − відомий неселективний блокатор калієвих каналів (Blatz et al. 1984, Benham et al. 1985). В концентрації 1 мМ ТЕА блокував вихідний струм, викликаний зміщенням мембранного потенціалу від підтримуваного рівня –60 мВ до +50 мВ, більш ніж на 50±6 % (n=6). Паксилін, при додаванні його в концентрації 100 нМ до розчину ТЕА (1 мМ), не викликав додаткового зменшення вихідного струму (рис. 3.А). В той же час, додаткова аплікація ТЕА (1мМ) (рис. 3.Б) в присутності паксиліну, призводить до подальшого пригнічення вихідного струму.

Раніше було показано (Повстян та ін. 2000), що I_K(Ca), який переносяться через К_Са великої провідності ефективно та однаково блокується наномолярними концентраціями харибдотоксину та ТЕА в концентрації 1 мМ. В той же час паксилін, високоспеціфічний блокатор К_Са каналів великої провідності призводить до меншого блокування, ніж ТЕА, і, відповідно, харибдотоксин.

В якості блокатора SК каналів було застосовано d-ТК, що є відомим модулятором нікотинових холінорецепторів (Wenningmann et al. 2001) та широко застосовується як в дослідницьких цілях, так і в медицині. Але відомі інші дані про його додаткові властивості, як блокатора К_Са каналів (Vacher et al. 1998, Ishii et al. 1997). В зв’язку з тим, що на ГМК кишечнику не встановлено наявність нікотинових холінорецепторів, це дало підстави використати та вивчити вплив d-ТК на іонні струми, що протікають через мембрану міоцитів. Аплікація d-ТК (500нМ–1мМ) пригнічувала вихідний трансмембранний струм, викликаний ступінчастим зміщенням мембранного потенціалу від підтримуваного рівня − 60 мВ, у концентраційно–залежний спосіб. З побудованої кривої доза-ефект, було встановлено, що концентрація половинного ефекту становить ІС₅₀ = 38±5 мкМ (n=7).

На рисунку 4. подано динаміку дії d-ТК на амплітуду вихідного струму з часом. Часова розгортка дії d-ТК (50 мкМ) показала, що повний ефект блокування досягав максимуму через 2,5 - 3,5 хвилини після початку прикладання блокатора. Постійна часу дії d-ТК складала 1 ± 0,2 хв (n=5). Відновлення амплітуди вихідного струму при відмиванні токсину 1,2 ± 0,2 хв (n=5).

Усереднені (n=9) ВАХ дії d-ТК на трансмембранний іонний струм наведено на рис 5. Як видно з рисунка, вклад d-TK чутливого струму в загальний вихідний струм на максимумі та в кінці деполяризуючого імпульсу, тривалістю 500 мс, був приблизно однаковим. Виходячи з динаміки кривої ВАХ можна зробити висновок, що канали, через які переноситься d-TKчутливий струм, не проявляють потенціалзалежних властивостей. Поряд з цим на ВАХ досить добре простежується максимум в районі +40 мВ, що не співпадає з максимумом I_Ca, котрий знаходиться в діапазоні потенціалів біля +10 мВ (рис 2). Подібні ефект було отримано на вісцеральних гладеньком’язових клітинах (Yamamoto et al. 1989, Zholos et al. 1992), що було, на думку авторів, пов’язано з кальційзалежними механізмами вивільнення кальцію з внутрішньоклітинного кальцієвого депо.

В наступних дослідах для розділення вихідного струму на компоненти та вивчення його характеристик було використано селективний блокатор BK каналів - паксилін (100нМ) (Gungdi et al. 1999). Додавання до зовнішнього розчину паксиліну викликало значне пригнічення вихідного струму (рис 6.А), та суттєво зменшувались осциляції. Додаткове додавання d-TK на фоні паксиліну викликало додатково незначне пригнічення вихідного струму. На рис 6. Б наведено дію d-ТК на вихідний струм. Як і в попередньому разі, d-ТК заблокував незначну частину вихідного струму, до того ж осциляції струму та його кінетика майже не змінилась. Додавання паксиліну до розчину в присутності d-ТК, призводило до значного пригнічення вихідного струму, при цьому значно зменшувались осциляції струму та його кінетика. Отриманні дані дозволяють зробити припущення, що паксилін та d-ТК діють на різні типи каналів незалежно один від одного. До того ж слід відмітити, що вклад паксилінчутливих каналів до загального вихідного струму значно більший, ніж вклад d-тубокураринчутливих каналів.

Властивості спонтанних вихідних струмів гладеньком’язових клітин. Друга частина роботи була присвячена вивченню характеристик спонтанних вихідних струмів (СВС), та впливу на них блокаторів калієвих каналів. В багатьох клітинах при деполяризуючих зміщеннях мембранного потенціалу виникали СВС, реєстрація яких проводилась протягом 100 с. СВС починали з’являтись при потенціалах більш позитивних ніж − 60 мВ (рис. 7). Як видно з рисунка, зі збільшенням мембранного потенціалу зростали амплітуда та частота зареєстрованих СВС.

СВС різної амплітуди можуть утворюватись за рахунок багаторазового локального звільнення Са²⁺ з внутрішньоклітинного депо, а також неоднорідності популяції кальційактивованих калієвих каналів. Як встановлено, в утворенні СВС приймають участь як ВК канали, так і SК канали. Окрім цього, в деяких роботах (Kong et al. 2000) припускають, що СВС малої амплітуди в більшості формуються за рахунок активації SК, в той час як СВС великої амплітуди − за рахунок активації ВК.

Дія блокаторів К_Са каналів, d-ТК та ТЕА, на СВС (підтримуваний потенціал – 30 мВ) наведено на рис. 8. Аплікація d-ТК, як блокатора SК каналів, призводила до пригнічення СВС малої амплітуди, в той час як частота появи СВС великої амплітуди майже не зменшувалась. Додавання ТЕА (1мМ) як блокатора ВК каналів, на фоні дії d-ТК призводило до пригнічення не тільки СВС великої амплітуди, але і залишкових СВС малої амплітуди. На рисунку 8.Б подано амплітудну гістограму блокуючої дії d-ТК та ТЕА на СВС мембрани ГМК. Ймовірно, що СВС великої амплітуди мають в своєму складі d-ТК чутливий компонент, що переноситься через SК канали. В той же час в формуванні СВС малої амплітуди приймає участь ТЕАчутливий компонент.

Ці дослідження показали, що СВС в ГМК taenia cаесі морської свинки є результатом відкривання ВК каналів, чутливих до дії паксиліну та ТЕА, та SК каналів, чутливих до дії d-TK.

Властивості спонтанних вихідних струмів, викликаних пуринергічною активацією ГМК кишечнику морської свинки. Активація пуринорецепторів мембрани інтестинальних ГМК аплікацією АТФ, доданого до зовнішнього розчину, активує К_Ca канали. Ми вивчали ефекти наведеного агоніста на струм при підтримуваному потенціалі − 40 мВ.

За таких умов АТФ в концентрації 100 мкM істотно підвищував частоту появи СВС, а особливо компоненти малої амплітуди. Приріст СВС малої амплітуди на максимумі складав 60% ±5% (n=4) (рис. 9).

У більшості ГМК локальне спонтанне вивільнення кальцію (спарки) обумовлено активністю ріанодинових депо, оскільки аплікація ріанодину викликає блокування спонтанного та підсиленого агоністами вивільнення іонів Са²⁺ (Guerrero-Hernandez et al. 2002). З іншого боку показано, що виділення кальцію з інозитолтрифосфат (ІР₃) - керованого депо є як джерелом активності Са²⁺ “puffs” в гладеньких м`язах, так і регенеративної взаємодії між виділенням кальцію з ІР<sub>3</sub> рецепторів та ріанодинових рецепторів (Boittin et al., 2000). Зазвичай, підсилення продукції ІР<sub>3</sub> та наступне виділення Са<sup>2+</sup> є характерною рисою для відповіді на аплікацію гальмуючих агоністів в гладеньких м`язах. У випадку гладеньких м`язів ШКТ, цей механізм може пояснити пригнічувальну дію АТФ, який вважається гальмівним нейротрансміттером, виділеним з ентеро-мотонейронів (Shuba et al. 2003).

Преінкубація клітин в розчині, що містив 30 мкМ 2-АРВ, блокатора ІР₃ рецепторів, протягом 10 хвилин показала, що прикладення АТФ (100 мкМ) не призводить до суттєвих змін у частоті появи викликаних СВС, як малої так і великої амплітуди (рис. 10). Окрім цього, інкубація в розчині 2-АРВ призводить до незначного зменшення частоти СВС малої амплітуди (дані не наведено), що може свідчити про залежність цієї частини СВС від кальцію, що звільняється з ІР₃ чутливого депо. До того ж можна припустити, що активація ІР₃ залежного депо виступає пусковим механізмом в ефекті активації гальмування, викликаного АТФ.

Для блокування ІР₃ шляху застосовували блокатор фосфоліпази С (U73122). За таких умов не відбувалось збільшення частоти СВС при аплікації АТФ. (Рис. 11). Відсутність збільшення частоти СВС у відповідь на аплікацію АТФ на фоні U73122 до зовнішнього розчину свідчить, що ІР₃ залежне збільшення вивільнення кальцію − основний механізм P2Y рецептор-модульованої стимуляції вихідного струму та гіперполяризації. Вивільнення кальцію асоційоване з активацією SK та BK каналів міоцитів taenia caeci.

На рис. 12 подано вплив блокаторів К_Са каналів на викликані агоністіндукованою активацією СВС. Потенціал фіксації становив – 40 мВ. Як видно d-ТК, як антагоніст SK каналів, в концентрації 50 мкМ послаблював СВС малої амплітуди (Рис. 12). СВС записано протягом 100 сек. реєстрації (n= 5). СВС великої амплітуди були також дещо пригнічені застосуванням d-ТК. Це вказує на наявність в складі викликаних СВС великої амплітуди компоненти струму d-ТКчутливих каналів. Результати свідчать, що СВС у ГМК taenia caeci морської свинки, є результатом відкривань BK каналів та d-ТКчутливих каналів. Аплікація ТЕА (1 мМ), як неселективного блокатора ВК каналів, на фоні дії d-ТК блокувала не лише СВС великої амплітуди, але і залишкові СВС малої амплітуди. На рис. 12 Б. наведено амплітудну гістограму блокуючої дії d-ТК та ТЕА на СВС, індуковані аплікацією АТФ. Пригнічення SK каналів може призводити до редукції СВС великої амплітуди та сприйняття останніх в якості СВС малої амплітуди після застосування d-ТК.

ОБГОВОРЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ

 

В результаті проведених досліджень по розділенню сумарного трансмембранного іонного струму ГМК поздовжнього м’яза сліпої кишки (taenia саесі) морської свинки на компоненти, дослідженню їх фармако-біофізичних характеристик було показано, що при ступінчастій деполяризації мембрани в переносі вихідного струму приймають участь потенціалкеровані К⁺ канали затриманого випрямлення та два типи К_Са каналів, що узгоджується з літературними даними (Жолос та ін. 1986, Yamamoto et al 1989). Показано наявність паксилінчутливого I_K(Ca), що переноситься через ВК, та паксиліннечутливого компоненту. Раніше було показано (Повстян та ін. 2000), що I_K(Ca), які переносяться через К_Са великої провідності, ефективно блокуються наномолярними концентраціями харибдотоксину та ТЕА в концентрації 1 мМ. В той же час паксилін, високоспеціфічний блокатор К_Са каналів великої провідності не призводив до блокування вихідних струмів, як це було показано для харибдотоксина та ТЕА. На фоні дії паксиліну (100 нМ) ТЕА в концентрації 1 мМ проявляв подальше пригнічення вихідних К⁺ струмів. ВАХ паксиліннечутливого компоненту виявила, що цей струм проявляє потенціалзалежні властивості, тобто зі збільшенням рівня деполяризації відбувається збільшення його амплітуди. Поряд з цим вольт-амперна характеристика має перегин в області максимуму кальцієвого струму, що може свідчити про залежність цього струму від внутрішньоклітинної концентрації кальцію. Це вказує на наявність паксиліннечутливого компоненту К⁺ струмів, який блокується менш селективними блокаторами, такими як ТЕА та харибдотоксин, останній має блокуючий вплив, як на ВК канали (Knaus et al. 1994, Orio et al. 2002), так і на К_Са проміжної провідності (ІК) (Bychkov et al. 2002, Edwards et al. 1998; 2000). З’ясування природи цього компоненту К⁺ струму вимагає застосування більш селективних блокаторів К⁺ каналів.

Другий вагомий компонент К_Са струму переноситься через К_Са канали малої провідності, для яких селективним блокатором виступає апамін (Shuba et al. 1981, Shuba et al. 2000, Burnham et al. 2002). Але, як було показано (Повстян та ін. 2000), апамін має побічну дію у вигляді активації каналів, що переносять неселективний катіонний струм. Для усунення невизначеності дії апаміну, в наших дослідах в якості блокатора SК каналів було застосовано d-TK, що є відомим модулятором нікотинових холінорецепторів та широко застосовується, як в дослідницьких цілях, так і в медицині (Wenningmann et al. 2001). Але окрім впливу на нікотинові холінорецептори існують дані про його додаткові властивості, як блокатора К_Са каналів (Wang et al. 1999, Barfod et al. 2001). В зв’язку з тим, що на ГМК кишечнику не встановлено наявність нікотинових холінорецепторів, це дало підстави використати та вивчити вплив d-ТК на іонні струми, що протікають через мембрану ГМК taenia cеасі морської свинки.

Ефект блокування I_K(Ca) аплікацією d-ТК досягав максимума через 2,5 - 3,5 хвилини після початку прикладення блокатора. I_K(Ca), що переноситься через SК канали, не проявляв на відміну від паксилінчутливого струму, часозалежної інактивації та потенціалзалежних властивостей. Крива ВАХ цього струму мала максимум в діапазоні + 30, + 50 мВ, що не співпадає з максимумом кальцієвого струму котрий знаходиться в діапазоні потенціалів біля +10 мВ. Подібні ефекти було описано на вісцеральних гладеньком’язових клітинах (Yamamoto et al. 1989, Zholos et al. 1992), та були пов’язані з кальційзалежними механізмами вивільнення кальцію з внутрішньоклітинного кальцієвого депо. Поряд з цим дослідження, проведені по вивченню впливу d-ТК на вхідні Са²⁺ струми показали, що d-ТК не впливає на потенціалзалежні Са²⁺ канали L – типу, котрі були виявлені на мембрані ГМК (Yamamoto et al. 1989, Жолос та ін. 1986, Зима та ін. 1994), що збігається з літературними даними (Wang et al. 1999).

Окрім наведених відмінностей встановлено, що ВК та SK канали сильно відрізняються по чутливості до ТЕА, неселективного блокатора К⁺ каналів. Як було сказано вище, ВК канали блокуються при додаванні до зовнішнього розчину ТЕА в низьких концентраціях, що в наших дослідах складало 1 мМ. В той же час SK канали, що з успіхом блокувались низькими концентраціями d-ТК (50 мкМ), виявились нечутливими до аплікації ТЕА навіть в концентраціях 4 – 5 мМ, що узгоджується з літературними даними (Latorre et al. 1983, Blatz et al. 1984, Benham et al. 1985). Більше того, було показано (Blatz et al. 1986), що ТЕА не виявляє блокуючої дії на SK канали навіть в великих концентраціях (20– 25 мМ).

Одною з найважливіших характеристик I_K(Ca), що переноситься як через ВК канали так і SK канали, є чутливість цих каналів до зміни [Са²⁺]_i. З літературних джерел відомо (Becker et al. 1989, Ganitkevich et al. 1991), що при фізіологічних умовах [Са²⁺]_i в ГМК знаходиться в діапазоні 100 – 120 нМ. При деполяризуючих зміщеннях мембранного потенціалу до 0 мВ [Са²⁺]_i різко зростає, досягаючи рівня 1000 нМ, після чого спадає до стаціонарного рівня 200 – 300 нМ, на якому продовжує триматися протягом декількох секунд до припинення деполяризації. Аналогічні дані були отриманні в дослідах на тонкому кишечнику мишей (Vogalis et al. 1997). В цій роботі було визначено порогову [Са²⁺]_i необхідну для активації К⁺ каналів, що становила 85 нМ. В той же час для активації ВК каналів необхідна значно вища [Са²⁺]_i, ніж для SК каналів. Проведені досліди з використанням іонів Со²⁺ в зовнішньому розчині також підтверджують дані, що для активації ВК каналів необхідне значне підвищення [Са²⁺]_i за рахунок надходження іонів Са²⁺ ззовні клітини, та/або вивільнення їх з внутрішньоклітинного депо.

Відносний вклад кожного з компонентів в сумарний вихідний струм варіював у різних клітин, але в більшості випадків величина їх залишалась в певних межах. Було встановлено, що близько 90% вихідного трансмембранного струму переноситься через потенціалкеровані К⁺ канали “затриманого випрямлення” та ТЕАчутливі ВК канали. В свою чергу, більш детальний вклад кожного компоненту до загального струму варіював наступних межах: 30 – 45% для Са²⁺незалежного К⁺ струму “затриманого випрямлення”, 40 – 50% для паксилінчутливого I_K(Ca), що переноситься через ВК канали, 5 – 15% для ТЕАчутливого I_K та 5 – 15% для d-ТКчутливого I_K(Ca), що переноситься через SК канали. Потрібно наголосити, що результати про процентний вклад кожного з вищеназваних компонент до загального вихідного струму, отримані за допомогою фармакологічного розділення, співпадали з результатами отриманими за допомогою віднімання окремих компонент вихідного струму.

Отриманні нами дані свідчать, що в ГМК taenia cаесi морської свинки окрім викликаних вихідних калієвих струмів можуть також виникати СВС. На сьогоднішній день аналогічні струми вже описані в багатьох ГМК: трахеї, різних відділах кишечнику та кровоносних судин (Шуба 1965, Bolton et al. 1996). Фізіологічна роль СВС, поки що достеменно невідома.

Велике зацікавлення викликає питання з приводу джерела Са²⁺ , необхідного для активації кожного зі згаданих раніше компонентів I_K(Ca). На сьогодні існує багато думок з цього приводу. Проведені нами досліди, а також отриманні раніше дані (Cole et al. 1989, Повстян та ін. 1997) наочно демонстрували, що амплітуда вихідного К⁺ струму, через наявність Са²⁺чутливої компоненти, сильно залежить від кількості Са²⁺, що входить до клітини через потенціалкеровані Са²⁺ канали під час деполяризуючого зміщення мембранного потенціалу. Блокування цих каналів іонами Со²⁺ призводило до значного пригнічення вихідного струму. Нездатність паксиліна пригнічувати вихідний струм в умовах блокування входу іонів Са²⁺ в клітину може слугувати доказом того, що для активації К_Са каналів великої провідності ГМК taenia caeci морської свинки необхідне значне підвищення [Са²⁺]_i в даному разі за рахунок входу іонів Са²⁺ ззовні через потенціалкеровані Са²⁺ канали L-типу. В той самий час, для активації SК потрібно незначне підвищення [Са²⁺]_i вище порогового рівня, як зазначалось раніше, близько 85 нМ (Vogalis, Goyal 1997).

В той же час було виявлено, що іони Ca²⁺, які спонтанно вивільняються з саркоплазматичного ретикулуму (СР), так звані Са²⁺ спарки, також можуть викликати активацію К_Са , при цьому активність каналів буде проявлятись у вигляді СВС (Bolton et al. 1996, Gordienko et al. 1998, Bayguinov et al 2001). Са²⁺ спарки призводять до локального підвищення [Са²⁺]_i, що в свою чергу призводить до активації невеликої кількості К_Са (10-100) (Бурый та ін. 1992, Benham et al. 1986), які генерують появу СВС. Лише суттєве вивільнення Са²⁺ з СР (викликане наприклад аплікацією кофеїну) може призвести до активації великої кількості К_Са каналів та викликати появу вихідного інтегрального макроструму (Гордиенко та ін. 1995, Повстян та ін. 2000). Однак в реальних умовах, подібне масове вивільнення Са²⁺ депо видається мало ймовірним.

В одній з недавніх робіт, що стосувалась вивчення впливу апаміна на іонні струми ізольованих ГМК ШКТ (Kong et al. 2000) було показано, що СВС можна розділити на два типи – великої та малої амплітуди. Перші блокувались харибдотоксином та утворювались завдяки активації ВК каналів, а другі − апаміном, і, відповідно формувались SК каналами. Проведені нами досліди показали, що паксилін ефективно блокував СВС великої амплітуди, при цьому частота СВС малої амплітуди майже не змінювалась, і, відповідно, не блокувались паксиліном. що узгоджується з наведеними даними. В той же час d –TK призводив до блокування СВС малої амплітуди, що може свідчити про те, що вони формуються за рахунок активації SК. ТЕА неселективний блокатор К⁺ каналів, на відміну від паксиліна, блокуючи СВС великої провідності також незначно пригнічував СВС малої амплітуди. Як було показано, на інтегральних струмах існує К⁺ провідність, яка нечутлива до паксиліну, але блокується ТЕА, і відповідно робить вклад в СВС малої амплітуди.

Підсумовуючи вище згадані дані, можна зробити висновок, що в ГМК taenia cаесi морської свинки існує щонайменше два компоненти I_K(Ca). Ці компоненти відрізняються між собою не лише провідністю каналів, через які вони переносяться, але і їх чутливістю до [Са²⁺]_i та змін мембранного потенціалу, а також відрізняються кінетичними характеристиками. Окрім наведеного вище, ці канали відрізняються чутливістю до блокаторів (d-TK, паксиліну, ТЕА). Так, d–TK виступає ефективним блокатором SК каналів ГМК ШКТ та може бути використаний, як інструмент для розділення та вивчення іонних струмів.

Локальне підвищення Са²⁺ виступає важливою ланкою в регуляції мембранного потенціалу, збудливості клітини та агоністіндукованих реакцій (Gordienko et al. 1998, Collier et al. 2000). Ці процеси є безпосереднім результатом вивільнення іонів Са²⁺ через ріанодинчутливі канали, або через ІР₃ активовані канали на саркоплазматичному ретикулумі. В деяких клітинах, локальне вивільнення Са²⁺ може призводити до утворення так званої Са²⁺ хвилі, що може розповсюджуватись навколо місця ініціації та через всю клітину (Gordienko et al. 1998, Jaggar et al. 2000). Локальне вивільнення Са²⁺ в безпосередній близькості до плазматичної мембрани, викликає просторово обмежене збільшення концентрації останнього, що сягає 1 мкМ (Perez et al. 1999). Таке локальне підвищення [Са²⁺]_i активує Са²⁺залежні іонні канали, що розташовані поблизу місця вивільнення іонів Са²⁺. Тому головним зв’язуючим ланцюгом між вивільненням Са²⁺ та клітинною відповіддю, виступає активація іонної провідності в плазматичній мембрані.

Активація вихідного калієвого струму відповідає за генерацію неадренергічних нехолінергічних гальмівних синаптичних потенціалів (НАНХ ГСП). На сьогоднішній день загальноприйнята думка, що АТФ, так само як і NO, виступає медіатором гальмівної нейропередачі в ШКТ (Шуба та ін. 1998, Shuba et al.2003, Moore et al. 1990). В taenia cаесi морської свинки стимуляція НАНХ-нейронів призводила до генерації двофазного ГСП (И.А. Владимирова та ін. 1984,1993). Повільний компонент цього ГСП блокується інгібіторами NO-синтази та харибдотоксином, блокатором BК каналів (Шуба та ін. 1998, Shuba et al. 2003, Загороднюк та ін. 1994), а швидкий – антагоністом пуринорецепторів суруміном, та блокатором SК каналів апаміном (Владимирова та ін. 1986, Шуба та ін. 1998, Shuba et al. 2003). Проведені нами досліди по вивченню впливу АТФ на поодинокі ГМК taenia cаесi морської свинки показали, що АТФ (100 мкМ) при підтримуваному потенціалі в –40 мВ, призводив до значного приросту СВС малої амплітуди. При цьому частота СВС великої амплітуди сильно не змінювалась. Як було вказано раніше, СВС малої амплітуди формуються здебільшого за рахунок активації SК каналів. Прикладення d-TK, як блокатора SК каналів, призводило до значного пригнічення СВС малої амплітуди, та усунення впливу АТФ. Це збігається з існуючими даними на багатоклітинних препаратах, уявленнями та літературними даними (Bayguinov et al. 2000, Shuba et al. 2003). Для встановлення джерела кальцію, що задіється в цих процесах було використано мембраннопроникний антагоніст ІР₃ рецепторів – 2-аміноетоксидифеніл борат (2-АРВ) (Maruyama et al. 1997). Преінкубація клітин в розчині з 2-АРВ (30 мкМ) не призводила до суттєвих змін СВС, активованих вивільненням Са²⁺ з ріанодинових депо. В той же час ефект збільшення частоти СВС при аплікації АТФ був відсутній. Дослідження, проведені на багатоклітинних препаратах показували, що 2-АРВ пригнічував ГСП, викликані інтрамуральним подразненням у препаратах caecum та colon, а також АТФ та НА – викликану гіперполяризацію (Shuba et al. 2003). Це дає можливість зробити висновок, що вивільнення Са²⁺ з ІР₃чутливого кальцієвого депо виступає проміжною ланкою в передачі між P2Y рецепторами і активуванням К_Са каналів малої провідності, які приймають участь у генерації апамінчутливого ГСП.

АТФ, як гальмівний нейромедіатор, взаємодіє у гладеньких м’язах з P2Y рецепторами, котрі відносяться до групи метаботропних рецепторів. Ці рецептори зв’язані з внутрішньоклітинними G-білками (G_q/11) завдяки яким активують фосфоліпазу С (Kьgelgen et al. 2006). Для визначення ролі фосфоліпази С у генерації АТФ-індукованої відповіді, було використано інгібітор фосфоліпази С – U73122 (Smith et al. 1990). За таких умов, додавання АТФ на фоні U73122 (5 мкМ) не призводило до зміни частоти появи СВС, як великої так і малої амплітуди. На багатоклітинних гладеньком’язових препаратах caecum (Shuba et al. 2003), застосування U73122, призводило до зменшення амплітуди ГСП, викликаного інтрамуральним подразненням, у порівнянні з тестовим майже на 50%. Наступне додавання апаміну, блокатора К_Са малої провідності, призводило до повного блокування ГСП, та появи нехолінергічних збуджуючих синаптичних потенціалів.

Наведені дані дозволяють припустити, що пуринергічна активація СВС є результатом локального вивільнення іонів Са²⁺ із саркоплазматичного ретикулуму, внаслідок активації P2Y рецепторами фосфоліпази С та задіяного нею інозитолтрифосфатного механізму.

ВИСНОВКИ

1.         За допомогою метода фіксації потенціалу було показано, що вихідний трансмембранний іонний струм ГМК taenia caeci морської свинки має три складові: потенціалзалежний струм «затриманого випрямлення» та два компоненти Са²⁺залежного К⁺ струму.

2.          Вихідний калієвий струм на 50% блокується неселективним блокатором ВК каналів ТЕА (1мМ), та на 40% − селективним блокатором ВК каналів паксиліном (100 нМ).

3.         Близько 10% вихідного калієвого струму пригнічується блокатором нікотинових холінорецепторів та К_Ca каналів d-ТК в концентрації 50 мкМ.

4.         Спонтанні вихідні струми (СВС) за своїми ознаками можна розділити на струми малої та великої амплітуди. СВС великої амплітуди чутливі до паксиліну та ТЕА. Це вказує, що вони переносяться через ВК канали. СВС малої амплітуди чутливі до дії d-ТК, що свідчить про активацію SК каналів.

5.         Блокатор ІР₃ рецепторів 2-АРВ (30 мкМ) пригнічує частоту СВС малої амплітуди та не впливає на СВС великої амплітуди. Це свідчить, що результатом виникнення СВС малої амплітуди є вивільнення Са²⁺ з ІР₃чутливого Са²⁺ депо міоцитів.

6.         Активація пуринорецепторів шляхом прикладення АТФ (100 мкM) супроводжується значним приростом частоти СВС малої амплітуди, що обумовлено активацією SК каналів чутливих до дії d-TK.

7.         АТФ в присутності селективного блокатора фосфоліпази С U73122 (5 мкМ) не впливає на частоту та амплітуду СВС

8.         АТФ-індукований Са²⁺ залежний калієвий струм в міоцитах taenia caeci обумовлений залежним від фосфоліпази С збільшенням внутрішньоклітинного рівня ІР₃, та наступним вивільненням Са²⁺ з ІР₃ чутливого депо міоцитів.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ РОБІТ ЗДОБУВАЧА ЗА МАТЕРІАЛАМИ ДИСЕРТАЦІЇ