Навигация
Експериментальне вивчення протизапальної активності поліфенольного екстракту з надземної частини лядвенцю рогатого
53929
знаков
3
таблицы
0
изображений
МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я УКРАЇНИ
НАЦІОНАЛЬНИЙ ФАРМАЦЕВТИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ
ГАЛУЗІНСЬКА ЛЮБОВ ВАЛЕРІЇВНА
УДК 615.322:577.127.4:615.212:615.276
ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНЕ ВИВЧЕННЯ ПРОТИЗАПАЛЬНОЇ АКТИВНОСТІ ПОЛІФЕНОЛЬНОГО ЕКСТРАКТУ З НАДЗЕМНОЇ ЧАСТИНИ ЛЯДВЕНЦЮ РОГАТОГО
14.03.05. – фармакологія
Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата фармацевтичних наук
Харків – 2008
Дисертацією є рукопис
Робота виконана на кафедрі біологічної хімії Національного фармацевтичного університету, Міністерство охорони здоров’я України, м. Харків
Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор
ВОРОНІНА ЛАРИСА МИКОЛАЇВНА
Національний фармацевтичний університет,
МОЗ України, м. Харків,
завідувачка кафедри біологічної хімії
Офіційні опоненти: доктор медичних наук, професор
РИЖЕНКО ІРИНА МИХАЙЛІВНА
Національний фармацевтичний університет,
МОЗ України, м. Харків,
професор кафедри фармакології
доктор медичних наук, професор
ЗВЯГІНЦЕВА ТЕТЯНА ВОЛОДИМИРІВНА
Харківський державний медичний університет,
МОЗ України,
завідувачка кафедри фармакології
з медичною рецептурою
Захист дисертації відбудеться 15.02. 2008 року
о _13_ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.605.01 при
Національному фармацевтичному університеті за адресою: 61002, м. Харків, вул. Пушкінська, 53.
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного фармацевтичного університету (61168, м. Харків, вул. Блюхера, 4).
Автореферат розісланий 12.01.2008 року
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради,
доктор біологічних наук, професор Л.М. Малоштан
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Нестероїдні протизапальні препарати (НПЗП) вже більше 100 років активно використовуються в клінічній практиці та посідають провідне місце в фармакотерапії багатьох захворювань запального ґенезу (Дзяк Г.В., 1999; Белоусов Ю.Б., 2000; Насонов Е. Л., 2002; Барсукова Е.Л., 2004; Свинцицкий А. С., 2004). Враховуючи широке споживання НПЗП, важливим є питання про ефективність та безпеку їх використання, тому що вони займають одне з перших місць за кількістю та важкістю побічних ефектів (Насонов Е.Л., 1998; Ушкалова Е.А., 2005; Штриголь С.Ю., 2005).
На першому місці серед ускладнень при застосуванні НПЗП стоїть ураження шлунково-кишкового тракту (ШКТ) (Григорьев П.Я., 1997; Dequeker J.,1998). Більшість з препаратів здатна викликати побічні ефекти з боку ЦНС, які за частотою займають друге місце після гастропатій (De Broe M.E., 1999; Hawkey C.J., 2003). Різноманітні прояви з боку шкіри і слизових оболонок складають 8-10% усіх побічних реакцій і відзначаються при використанні піразолонів і піразолідонів (Гребенева Л.С., 1997; Насонов Е.Л., 2000). НПЗП властива також гепатотоксична дія (Меньшикова Е.Б., 1997; Nyompa A.M., 1996), здатність викликати важкий бронхоспазм (Дзяк Г.В., 2000), гемолітичну анемію, тромбоцитопенію (Насонов Е. Л., 2002). Не менш серйозною проблемою, масштаби якої стали очевидними тільки останнім часом, є НПЗП-індукована нефротоксичність (Hao C.M, 1999; Fored C.M., 2001; Wali R. K., 2002).
Таким чином, пошук ефективних НПЗП, у яких би була відсутня побічна дія при збереженні потужного протизапального ефекту, залишається актуальною проблемою сучасної фармакології.
Важливим напрямком у вирішенні цієї проблеми є створення нових протизапальних препаратів на основі рослинної сировини, які мають нижчу токсичність та меншу кількість побічних ефектів, ніж синтетичні НПЗП (Сандер С.В., 1996; Чекман І.С., 2001).
Виходячи з цього, увагу привернули рослини роду Лядвенець (Lotus L.) родина бобових (Fabaceae), які широко представлені у світовій флорі (Середземномор’я, Середня та Східна Азія, Європа, а також Україна) і нараховують 80 видів. Найбільш розповсюджений на Україні Лядвенець рогатий (Lotus corniculatus) (Яковлев Г.П., 1991). На кафедрі фармакогнозії НФаУ з надземної частини Лядвенцю рогатого було розроблено та отримано новий поліфенольний екстракт під умовною назвою “Локорин” (Король В.В., 1999). Хімічний склад екстракту “Локорин” дозволяє припустити широкий спектр його фармакологічної активності, включаючи і протизапальну дію.
У зв’язку з цим експериментальне обґрунтування застосування екстракту “Локорин” є доцільним, та перспективною є можливість створення на його основі нового лікарського препарату, який розширить номенклатуру існуючих рослинних лікувальних засобів і, можливо, стане альтернативою сучасним НПЗП.
Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана у рамках науково-дослідної програми Національного фармацевтичного університету з проблеми МОЗ України “Фармакологічне дослідження біологічно активних речовин і лікарських засобів синтетичного та природного походження, їх застосування в медичній практиці” (№ Державної реєстрації 0103U000478).
Мета та завдання дослідження. Метою даної роботи є вивчення фармакодинаміки поліфенольного екстракту “Локорин” і обґрунтування його терапевтичної ефективності на різних стадіях запального процесу.
Для досягнення вказаної мети були поставлені наступні завдання:
1. Провести фармакологічний скринінг протизапальної, анальгетичної, жарознижувальної активності екстракту “Локорин” та визначити ЕД50 за протизапальною активністю.
2. Дослідити протизапальну дію екстракту “Локорин” на моделях запалення з вираженим ексудативним компонентом з використанням різних флогогенів.
3. Провести дослідження антипроліферативних властивостей екстракту “Локорин”.
4. Вивчити вплив екстракту “Локорин” на перебіг запалення з вираженим альтеративним компонентом на моделях спиртово-преднізолонової і індометацинової виразок шлунка та “трафаретної рани”.
5. З’ясувати антиоксидантну дію екстракту “Локорин” на моделях з мембранною патологією.
6. Вивчити параметри гострої токсичності досліджуваного екстракту та його вплив на функціональний стан ШКТ.
Об’єкт дослідження. Протизапальні властивості поліфенольного екстракту “Локорин”, вплив на перебіг запалення у щурів при різних модельних патологіях, антиоксидантна дія, а також його токсичні властивості.
Предмет дослідження. Поліфенольний екстракт з надземної частини Лядвенцю рогатого під умовною назвою “Локорин”.
Методи дослідження. При виконанні дисертаційної роботи використовувався комплексний методичний підхід із залученням фармакологічних, токсикологічних, біохімічних, гематологічних, гістологічних та статистичних методів дослідження.
Наукова новизна. Вперше на основі результатів експериментальних досліджень встановлена виразна протизапальна дія екстракту “Локорин” на різних модельних патологіях запалення, які характеризуються виразністю окремих фаз запального процесу (ексудації та альтерації).
Показана висока антиексудативна активність екстракту “Локорин” на моделях гострого запалення, репаративна, кардіопротекторна, гепатопротекторна, противиразкова дія.
Встановлено, що протизапальна дія досліджуваного екстракту обумовлена його мембранопротекторними, антиоксидантними та капілярозміцнювальними властивостями.
Доведено, що досліджуваний екстракт відноситься до класу відносно нешкідливих речовин і не чинить негативного впливу на функцію ШКТ (не впливає на секрецію шлункового соку, перистальтику кишечнику, не чинить місцевоподразнювальної дії на слизову оболонку шлунка).
Наукова новизна дисертаційної роботи підтверджена деклараційним патентом на корисну модель № 18309 “Безвідходний спосіб одержання біологічно активних комплексів з Лядвенцю рогатого” від 15.11.2006 р.
Практичне значення одержаних результатів. За результатами експериментальних досліджень розроблений та виданий інформаційний лист №23–2007 “Використання субстанцій рослинного походження „Локорин” та густого екстракту з листя Винограду культурного для розробки гепатозахисних засобів”.
Результати проведених досліджень впроваджені в навчальний процес на кафедрах: експериментальної та клінічної фармакології з клінічною імунологією та алергологією “Українська медична стоматологічна академія” Вищого державного навчального закладу України (м. Полтава) та військової фармації Української військово-медичної академії (м. Київ).
На підставі експериментальних даних доведена доцільність проведення подальших досліджень з метою створення лікарської форми екстракту “Локорин”.
Особистий внесок здобувача. Дисертаційна робота виконана на кафедрі біологічної хімії та на базі ЦНДЛ НФаУ. Разом з науковим керівником сформульовані мета та завдання дослідження, розроблені методичні підходи до вибору адекватних моделей при виконанні експериментальної частини роботи. Особисто проведені інформаційно-патентний пошук, аналіз джерел літератури, експериментальні дослідження, статистична обробка, аналіз та систематизація отриманих результатів, сформульовані основні положення та висновки дисертації.
Апробація роботи. Основні положення дисертаційної роботи викладалися та обговорювалися на: ІІІ Міжнародній науково-практичній конференції “Наука і соціальні проблеми суспільства: медицина, фармація, біотехнологія” (м.Харків, 2003); Всеукраїнському науково-практичному семінарі “Перспективи створення в Україні лікарських препаратів різної спрямованості дії” (м.Харків, 2004); V Всеукраїнській науково-методичній конференції “Клінічна фармація в Україні” (м.Харків, 2004); Всеукраїнській науково-методичній конференції “Хімія природних сполук” (м.Тернопіль, 2005); Міжнародній науково-практичній конференції “Розвиток наукових досліджень 2005 р.” (м.Полтава), ІІІ Національному з’їзді фармакологів України (м.Одеса, 2006).
Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 10 статей, з них 5 - у фахових виданнях, ліцензованих ВАК України, 6 тез доповідей, 1 патент та 1 інформаційний лист .
Об’єм і структура дисертації. Дисертаційна робота складається з переліку умовних скорочень, вступу, літературного огляду, опису матеріалів та методів дослідження, 4-х розділів власних досліджень, аналізу отриманих результатів, висновків та переліку використаної літератури. Загальний об’єм дисертації складає 170 сторінок машинописного тексту. Робота ілюстрована 36 таблицями, 14 рисунками. Список використаних джерел літератури складає 246 найменувань, з яких 121 – іноземних авторів.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Матеріали та методи дослідження. Фармакологічні дослідження проведені на 636 білих безпородних статевозрілих щурах обох статей масою 150-220г та 53 білих безпородних статевозрілих мишах масою 20-30г, що були вирощені в розпліднику віварію ЦНДЛ НФаУ та утримувались на збалансованому стандартному раціоні у відповідності з санітарно-гігієнічними нормами (Науково-практичні рекомендації з утримання лабораторних тварин та роботи з ними, 2002). Експерименти проводили згідно з „Загальними етичними принципами експериментів на тваринах” (Україна, 2001), що узгоджуються з положеннями „Європейської конвенції про захист хребетних тварин, які використовуються для експериментальних та інших наукових цілей” (Страсбург, 1985).
Основні етапи проведених досліджень представлені на схемі.
Відомо, що патофізіологічними проявами запалення є біль, набряк, гіперемія, гіпертермія та порушення функції органу (Алексеев В.В., 2003). Тому на етапі скринінгових досліджень вивчали антиексудативну активність на моделі гострого карагенінового набряку, анальгетичну активність на моделі “оцтовокислих корчів” (Доклінічні дослідження лікарських засобів, 2001) жарознижувальну дію на моделі “молочної лихоманки” (Тринус Ф.П., 1974). Екстракт “Локорин” досліджували в дозах 10, 25, 50, 100 та 200 мг/кг при одноразовому внутрішньошлунковому введенні щурам. Як препарати порівняння служили диклофенак натрію (ЕД50, 8 мг/кг) і гранули кверцетину в умовно терапевтичній дозі 5 мг/кг − антиексудативна активність; анальгін (ЕД50, 55 мг/кг) і диклофенак натрію (ЕД50, 5 мг/кг) − анальгетична активність; ацетилсаліцилова кислота (АСК) (ЕД50 , 50 мг/кг) та диклофенак натрію (ЕД50, 5 мг/кг) − жарознижувальна активність.
При поглибленому вивченні протизапальної дії екстракту “Локорин” важливим було дослідити його вплив на такі стадії запалення, як альтерація, ексудація і проліферація.
Дослідження антиексудативних властивостей екстракту “Локорин” у дозі ЕД50, 50 мг/кг проводили на моделях запалення задньої кінцівки у щурів з використанням таких флогогенів, як 0,1% розчину гістаміну, 2% суспензії зимозану і на моделі гострого асептичного перитоніту (Доклінічні дослідження лікарських засобів, 2001).
Антиексудативну дію екстракту в умовах експериментального перитоніту вивчали через добу після внутрішньоочеревинного введення щурам розчину Люголю і оцінювали за показником приросту окружності черева, а також біохімічними показниками сироватки крові: вмістом глікопротеїнів (ГП) (Штейнберг О.П., Доценко Я.Н., 1984), концентрацією сіалових кислот та середніх молекул (Камышников В.С., 2000). Експерименти проводили у порівнянні з диклофенаком натрію та кверцетином.
Антипроліферативну активність екстракту “Локорин” визначали на моделі „ватної гранулеми” (Доклінічні дослідження лікарських засобів, 2001) і порівнювали з диклофенаком натрію та кверцетином.
На наступному етапі вивчали антиальтеративну активність екстракту
“Локорин” у дозі 50 мг/кг на таких модельних патологіях, як “трафаретні рани”, спиртово-преднізолонова виразка шлунка (Доклінічні дослідження лікарських засобів, 2001) та індометацинова виразка шлунка (Derelanko M. G., 1980).
|
ІІ етап
| ||||||
 | ||||||
| ||||||
 | ||||||
ІІІ етап
| ||||
 | ||||
ІVетап
|
Схема. Етапи та основні методи фармакологічних досліджень поліфенольного екстракту “Локорин”.
Інтенсивність альтеративного запалення на моделі стандартних шкіряних ран оцінювали за динамікою планіметричних показників (стан рани, їх площа) з 2-ої доби до повного загоєння ран (19-та доба), вмістом ГП та ТБК-реактантів (Стальная И.Д., Гавришвили Т.Г., 1977) в сироватці крові, а також за динамікою показників периферичної крові у щурів (Камышников В.С., 2000) на 5-ту, 9-ту та 13-ту добу досліду. Референс-препаратом був диклофенак натрію в дозі 8 мг/кг.
При вивченні противиразкової активності екстракту “Локорин” визначали показники, які узагальнено характеризують збалансованість ПОЛ та АОС у сироватці крові (спиртово-преднізолонова виразка шлунка), гомогенаті печінки (індометацинова виразка шлунка) та гомогенатах шлунка в умовах даних патологій у порівнянні з кверцетином у дозі 5 мг/кг.
Для встановлення антиоксидантної дії екстракту “Локорин” проводили вивчення його антиокиснювальних властивостей в системі in vitro на моделі спонтанного та аскорбатіндукованого ПОЛ в гомогенаті печінки (Владимиров Ю.А., Арчаков А.И.,1972). З метою підтвердження ефективності в умовах in vivo визначали антиоксидантну дію екстракту “Локорин” на моделі гострого тетрахлорметанового гепатиту. Мембраностабілізувальну активність екстракту “Локорин” вивчали за методом F.C.Jager (Вороніна Л.М. зі співавт., 1996), капілярозміцнювальну дію досліджували відповідно до методу Голікова П.П., 1964.
Гепатопротекторну активність вивчали на моделі гострого ураження печінки тетрахлорметаном. В умовах даної патології досліджували в гомогенаті печінки деякі показники ПОЛ - ТБК-реактанти, дієнові кон’югати (ДК), ацилгідропероксиди (АГП) (Стальная И.Д., Гавришвили Т.Г., 1977) та систему антиоксидантного захисту за вмістом відновленого глутатіону (GSH) (Beutler E.D., at al., 1963) та активністю каталази у гомогенаті печінки (Королюк М.А., 1988). У сироватці крові визначали активність аланінамінотрансферази (АлАТ), гамма-глутамілтранспептидази (г-ГТП), лужної фосфатази (ЛФ) у порівнянні з гепатопротектором силібором в дозі ЕД30, 25 мг/кг (Камышников В.С., 2000).
Морфоструктуру зразків печінки вивчали за допомогою стандартного методу світлової мікроскопії (Меркулов Г.А, 1969, Соколовский В.В., 1971).
Кардіопротекторну активність в умовах ізадринового міокардиту визначали за активністю ферментів аспартатамінотрансферази (АсАТ), лактатдегідрогенази (ЛДГ), креатинфосфокінази (КФК) (Камышников В.С., 2000) в сироватці крові та в гомогенаті серця досліджували вміст ТБК-реактантів та ДК (Стальная И.Д., Гавришвили Т.Г., 1977). Кардіопротекторну дію екстракту “Локорин” характеризували також за показниками ЕКГ і порівнювали з диклофенаком натрію в дозі 8 мг/кг.
Гостру токсичність з розрахунком середньолетальних доз при внутрішньошлунковому та внутрішньоочеревинному введенні мишам та щурам проводили за методом Пастушенко Т.В. зі співавт., 1978. Ступінь токсичності визначали за класифікацією Сидорова К.К., 1973. Вплив вивчаємого екстракту на стан слизової оболонки шлунка та секрецію шлункового соку вивчали за методом Андрєєвої Н.І. та Шарової С.Д., 1978, на рухову активність ШКТ згідно з методом Sticknay I.S., 1951.
Експериментальні дані оброблені методами варіаційної статистики з використанням критерію Ст’юдента (t) (Иванов Ю.И., Погорелюк Р.Н.,1990).
Результати досліджень та їх обговорення. Результати скринінгових досліджень протизапальної дії екстракту “Локорин”, яка включає антиексудативну, анальгетичну та жарознижувальну активності, наведені на рисунках 1-3.
Показано, що вплив екстракту “Локорин” на розвиток карагенінового запалення залежав від дози, яку вводили щурам. В дозах 10 мг/кг та 25 мг/кг антиексудативна активність на 3-й годині досліду (пік запалення) дорівнювала 3,7% та 37,5%, відповідно (рис. 1). Найбільша антиексудативна активність була в дозі 50 мг/кг (47,1%). Подальше підвищення її до 100 мг/кг та 200 мг/кг призводило до зменшення фармакологічного ефекту. ЕД50 досліджуваного екстракту дорівнювала 50 мг/кг. Антиексудативна активність екстракту “Локорин” наближалась до активності диклофенаку натрію (53,9%) та перевищувала таку у кверцетину в 1,7 рази. Отримані дані свідчать про можливість вивчаємого екстракту впливати на простагландинову фазу карагенінового запалення і пригнічувати циклооксигеназу. Більш виразна активність в порівнянні з кверцетином, можливо, обумовлена хімічним складом екстракту “Локорин”, до якого окрім флавоноїдів входять оксикоричні кислоти, дубільні речовини, і здатністю фенольних рослинних речовин пригнічувати ферменти циклооксигеназного шляху метаболізму арахідонової кислоти (Henry D. et al., 1996).
Рис.1. Скринінгове дослідження антиексудативної активності екстракту “Локорин” на моделі карагенінового запалення.
Примітки:
1.*- відмінність достовірна по відношенню до контрольної патології (р£ 0,05);
2.** - відмінність достовірна по відношенню до кверцетину (р£ 0,05).
Анальгетичну активність на моделі “оцтовокислих корчів” у щурів екстракт “Локорин” проявив в усіх досліджуваних дозах, але виразна дія була притаманна дозам 50 мг/кг та 100 мг/ кг (57,7% та 56,2%, відповідно) (рис.2). При цьому за анальгетичною активністю він не поступався анальгіну (60,6%) та перевищував активність диклофенаку натрію (45,1%). Результати досліджень свідчать про вплив екстракту “Локорин” на периферичні компоненти механізму розвитку болю, одним з яких є пригнічення фази ексудації запальної реакції і зменшення механічного тиску на больові рецептори.
| |
Рис.2. Скринінгове дослідження Рис.3. Скринінгове дослідження
анальгетичної активності жарознижувальної активності
екстракту “Локорин”. екстакту “Локорин”.
Примітки:
1.*- відмінність достовірна по відношенню до контрольної патології (р£ 0,05);
2.** - відмінність достовірна по відношенню до диклофенаку натрію (р£ 0,05).
Введення досліджуваного екстракту в різних дозах приводило до зменшення температури тіла у щурів з експериментальною лихоманкою (рис.3). Найбільшу жарознижувальну дію спостерігали в дозі 50 мг/кг (74,2 %). Підвищення дози до 200 мг/кг не виявило достовірного зменшення температури тіла у щурів. За жарознижувальною активністю екстракт “Локорин” у дозі 50 мг/кг перевищував ефект диклофенаку натрію в 1,3 рази, але значно поступався АСК. Ймовірно, антипірична дія екстракту проявляється за рахунок гальмування утворення простагландинів (ПГ).
Таким чином, наведені дані свідчать, що протизапальна дія екстракту “Локорин” у дозі 50 мг/кг може бути пов’язана із пригніченням циклооксигеназної активності та впливом на периферичні механізми формування болю. Ці результати стали підставою для подальшого вивчення його протизапальної дії в дозі ЕД50 − 50 мг/кг.
В зв’язку з цим, досліджували вплив екстракту “Локорин” на кожну стадію запалення: альтерацію, ексудацію та проліферацію.
Поглиблене вивчення антиексудативної активності проводили на моделях запалення задньої кінцівки у щурів з використанням різних флогогенів (зимозановий і гістаміновий набряки).
Аналіз результатів дослідження на моделі зимозанового набряку показав, що екстракт “Локорин” проявляв виражену антиексудативну активність, про що свідчило достовірне зменшення об’єму лапи щурів протягом всього експерименту (середня активність 38,6%). Оскільки екстракт виявляв високу антиексудативну активність (59,9 %) через 0,5 години (пік запалення) після введення тваринам зимозану, то можна припустити, що він має антиліпооксигеназну активність, яка перевершує активність диклофенаку натрію (29,8%), для якого характерна висока антициклооксигеназна дія (рис.4). Це підтверджується даними літератури, що лікарські препарати, які мають у своєму складі фенольні сполуки, інгібують ліпооксигеназу (Dehmlow C. et al., 1996). В той же час на 3-й годині експерименту антиексудативна активність екстракту “Локорин” становила 38,8%. Останнє дозволяє припустити, що на ранніх етапах розвитку запального процесу він активно пригнічує утворення лейкотриєнів, а через 3 години помірно гальмує синтез ПГ.
Рис.4. Антиексудативна активність екстракту “Локорин” на моделі зимозанового та гістамінового набряків задньої кінцівки у щурів.
Примітки:
1.*- відмінність достовірна по відношенню до контрольної патології (р£ 0,05);
2.** - відмінність достовірна по відношенню до диклофенаку натрію (р£ 0,05).
На моделі гістамінового набряку екстракт “Локорин” активно пригнічував розвиток набряку протягом 2-х годин (середня активність 43,4%). Антиексудативна активність препаратів порівняння диклофенаку натрію становила 40,8%, а кверцетину 35,9%. На рисунку 4 показано, що через 0,5 години (пік запалення) досліджуваний екстракт виразно зменшував ступінь набряку на 51,3% і не поступався ефекту референс-препаратів. Отримані дані пояснюються потужною судинозміцнювальною дією флавоноїдів (Чекман І.С., 2000), які входять до складу екстракту “Локорин”. Внаслідок цього зменшується проникливість кровоносних судин, що призводить до інволюції набряку.
В умовах гострого перитоніту у щурів, де в якості флогогену використовували розчин Люголя, після лікування екстрактом “Локорин” спостерігалось зниження приросту окружності черева у тварин в 2,1 рази в порівнянні з контрольною патологією. Антиексудативна активність екстракту становила 57,5% (рис. 5) і супроводжувалась більш низьким рівнем у сироватці крові тварин ГП, сіалових кислот, вміста середніх молекул (у 1,3; 1,8 та 1,9 рази, відповідно), ніж у щурів контрольної групи. Отримані результати свідчать про спроможність екстракту “Локорин” перешкоджати деструкції клітинних мембран і вираженій інтоксикації організму за рахунок обмеження ексудативних процесів.
Антиексудативна активність його співставлювана з аналогічним ефектом диклофенаку натрію (55,5%) і перевищувала ефект кверцетину (37,9%). Вірогідні переваги досліджуємого екстракту щодо гальмування впливу на вивільнення маркерів інтоксикації – середніх молекул і сіалових кислот, пов’язані, ймовірно, з дещо відмінним від кверцетину механізмом антиексудативної дії, а саме домінуючим впливом на ліпооксигеназний і вираженим на циклооксигеназний шляхи метаболізму арахідонової кислоти.
Таким чином, результати дослідів з вивчення протизапальної дії екстракту “Локорин” на всіх експериментальних моделях гострого запалення свідчать про високу антиексудативну активність.
Рис.5. Антиексудативна активність екстракту “Локорин” на моделі гострого асептичного перитоніту у щурів.
Примітки:
1.*- відмінність достовірна по відношенню до контрольної патології (р£ 0,05);
2.** - відмінність достовірна по відношенню до диклофенаку натрію(р£ 0,05);
3. *** - відмінність достовірна по відношенню до кверцетину (р£ 0,05).
Вивчення антипроліферативної активності екстракту “Локорин” показало, що вона була незначною і складала (29,1 %). Це співпадає з даними літератури, які підтверджують, що поліфенольні сполуки не спроможні активно подавляти фазу проліферації запалення (Чернов Ю.Н. и соавт., 1990).
В якості експериментальних моделей для дослідження антиальтеративної дії використовували моделі “трафаретної рани” та виразок шлунка (спиртово-преднізолонової та індометацинової).
Дослідження антиальтеративної дії виявили здатність екстракту “Локорин” впливати на репаративні процеси в рані, про що свідчило достовірне зменшення площі рани в 1,6 рази на 5 добу та прискорення швидкості їх загоєння в 3,3 рази, а під дією диклофенаку натрію лише в 2,2 рази в порівнянні з контрольною патологією. Під впливом екстракту у щурів в динаміці (5-й, 9-й та 13-й дні) спостерігалось поступове зниження в сироватці крові ТБК-реактантів, вмісту ГП та цитолітичного ферменту АлАТ, що вказує на пригнічення процесів ПОЛ і наявність у нього мембранопротекторних властивостей. Характерні зміни відмічались з боку гематологічних показників: достовірне підвищення кількості еритроцитів та внаслідок цього – гемоглобіну. На 13-й день дані показники були на рівні інтактного контролю. В той же час препарат порівняння менш активно і лише на 9-й та 13-й день починав нормалізувати вивчаємі показники. Проведені дослідження показали, що екстракт “Локорин” проявив більш виражену протизапальну дію, ніж НПЗП, про що свідчила динаміка показників крові: достовірне зменшення лейкоцитів (13-й день), тенденція до зниження кількості паличкоядерних, сегментоядерних нейтрофілів, моноцитів, та збільшення лімфоцитів у порівнянні з контрольною патологією. Аналіз отриманих даних свідчить, що протизапальні властивості екстракту “Локорин” виявляються як на початку, так і на пізніх етапах запального процесу. За протизапальними властивостями він перевищує ефект референс-препарату, що пов’язано зі спроможністю поліфенолів інгібувати розвиток процесів вільнорадикального окиснення (ВРО) та стабілізувати клітинні мембрани.
На наступному етапі було проведено вивчення противиразкової дії екстракту “Локорин”. Введення двох агресивних факторів - етилового спирту та преднізолону, який пригнічує активність фосфоліпаз, призводило до утворення виразок в шлунку у щурів. Застосування екстракту “Локорин” позначилось зменшенням ступеня виразкового дефекту на 55,3%, а кверцетину ¾ на 51,7%. (рис. 6).
Рис.6. Вплив екстракту “Локорин” на перебіг спиртово-преднізолонової виразки шлунка у щурів.
Примітки:
1.*- відмінність достовірна по відношенню до інтакту (р£ 0,05);
2.** - відмінність достовірна по відношенню до контрольної патології (р£ 0,05).
Гальмування процесу ПОЛ відобразилось достовірним до значень контрольної патології зменшенням у сироватці крові вмісту ТБК-реактантів у 1,8 рази, ДК у 1,4 рази, а позитивний вплив на стан АОС характеризувався збільшенням GSH у 1,2 рази. В гомогенаті шлунка простежувалась така ж сама тенденція відносно цих показників.
Лікування екстрактом “Локорин” індометацинової виразки достовірно зменшувало виразкоутворення більш, ніж в 2 рази, набряк та гіперемія слизової оболонки майже не спостерігались. Противиразкова активність екстракту “Локорин” складала 50,8%, а кверцетину 42,6% (рис.7). Згідно з даними літератури, введення щурам індометацину у великих дозах викликає порушення функціонального стану печінки: інтенсифікацію ПОЛ мембран гепатоцитів, зменшення резерву GSH (Derelanko M. G., 1980). Наші дослідження підтвердили гепатотоксичність даного НПЗП (рис.7). В умовах даної патології зміни показників ПОЛ та АОС при застосуванні екстракту “Локорин” мали спрямованість до нормалізації. Вщухання процесів ПОЛ на рівні шлунка також супроводжувалось достовірним зменшенням вмісту ТБК-реактантів в 1,5 рази та підвищенням в 1,3 рази глутатіонового захисту в гомогенаті печінки в порівнянні з нелікованими тваринам. Таким чином, в умовах експериментальних виразок шлунка у білих щурів доведена наявність у екстракту “Локорин” противиразкової дії, яка однакова за виразністю з ефектом кверцетину.
Рис.7. Вплив екстракту “Локорин” на перебіг індометацинової виразки шлунка у щурів.
Примітки:
1.*- відмінність достовірна по відношенню до інтакту (р£ 0,05);
2.** - відмінність достовірна по відношенню до контрольної патології (р£ 0,05).
Як відомо, протизапальна дія поліфенольних сполук частково пояснюється їх антиоксидантними, мембраностабілізувальними та капілярозміцнюючими властивостями (Чекман І.С., 2000). За даними Меньщикової Е.Б. та Зенкова Н.К., 1997, запальний процес є системною реакцією, що супроводжується інтенсифікацією процесів ВРО та накопиченням продуктів ПОЛ. Тому, на наступному етапі вивчали антиокиснювальні властивості екстракту “Локорин” in vitro та in vivo. Показано, що екстракт “Локорин” володіє вираженою антиокиснювальною активністю, яка в середньому вища за активність природного антиоксиданту−a-токоферола в 2,5 рази в умовах спонтанного ПОЛ і в 1,5 рази при індукції ПОЛ аскорбатом. При цьому спроможність екстракту блокувати процеси ліпопероксидації проявилась вже в перші хвилини після початку інкубації.
Отримані результати узгоджуються з даними Шкариної Е.І.з соавт., 1998 про те, що поліфенольні сполуки здатні зв’язувати активні метаболіти кисню, які є індукторами ПОЛ на ранніх етапах. Крім того, спроможність екстракту “Локорин” інгібувати аскорбатіндуковане ПОЛ, може бути також пов’язана зі здатністю флавоноїдів утворювати хелатні комплекси з металами, виключаючи їх каталітичну дію у процесах ПОЛ ( Казимирко В.К., 2004), і виступати екзогенними природними низькомолекулярними антиоксидантими.
У наступній серії дослідів вивчались антиоксидантні властивості екстракту “Локорин” in vivo на моделі гострого тетрахлорметанового гепатиту. При введенні його щурам в дозі 50 мг/кг вміст кінцевих продуктів ПОЛ ТБК-реактантів у гомогенаті печінки був суттєво нижчим у порівнянні з контролем, що свідчить про спроможність досліджуваного екстракту знижувати інтенсивність процесів ВРО. При цьому антиоксидантна активність екстракту “Локорин” і препарату порівняння a-токоферолу (ЕД50, 50 мг/кг) були однакові (46,8% і 44,4%, відповідно). Таким чином, показано, що досліджуємий екстракт суттєво покращує антиоксидантно-прооксидантний статус печінки за рахунок як пригнічення інтенсивності процесів ПОЛ та стабілізації клітинних мембран, так і зміцнення антиоксидантної системи захисту.
Антиоксидантні властивості є одним із компонентів мембраностабілізувальної дії екстракту, яка відіграє важливу роль в реалізації протизапального ефекту. Тому нами вивчалась мембранопротекторна активність екстракту „Локорин” на моделі спонтанного гемолізу еритроцитів. Отримані результати свідчать про високу мембранопротекторну дію досліджуваного екстракту (49,9%), яка достовірно не відрізнялась від такої у a-токоферолу (31%), але в 2,3 рази перевищувала активність кверцетину в дозі 5 мг/кг (21,6%). Це можна пояснити тим, що поліфенольні сполуки рослин здатні вбудовуватися в гідрофільну фазу мембран і виконувати функцію антиоксидантного резерву, що призводить до збалансованості компонентів ПОЛ−АОС і стабілізації фосфоліпідної матриці мембран. Дубільні речовини реагують з мембранними білками і утворюють з ними комплекси, що теж сприяє стабілізації клітинних мембран зі збереженням їх структури та функції (Барабой В.А., 1984; Чекман І.С., 2000)
Оскільки важливими фармакологічними властивостями рослинних поліфенолів є здатність ущільнювати клітинні мембрани та підсилювати резистентність стінок судин, було доцільним вивчити вплив екстракту “Локорин” на судинну проникність. Результати експериментів показали наявність у нього судиностабілізувального ефекту, який був найбільш вираженим на моделі уповільнення забарвлення зимозанової папули. Екстракт достовірно в 2 рази затримував вихід барвника з кровоносного русла відносно контрольної патології. На моделі гістамінової папули досліджуваний показник підвищувався в 1,4 рази, а при введенні щурам білку лише в 1,2 рази. Аналогічний судиностабілізувальний ефект показував і кверцетин ув дозі 50 мг/кг.
Вивчення антиоксидантних властивостей проводили на моделі тетрахлорметанового гепатиту. Введення екстракту “Локорин” у лікувально-профілактичному режимі запобігає активації вільнорадикальних реакцій і розвитку синдрома цитолізу гепатоцитів, що підтверджується позитивними змінами біохімічних показників (рис. 8). Так, зменшувався вміст АГП, ТБК-реактантів і ДК в гомогенаті печінки в 1,7 рази, 1,9 рази та 1,6 рази, відповідно в порівнянні з контрольною патологією. У тварин поліпшились показники АОС, зокрема, до норми зріс рівень GSH, а вміст каталази - в 1,5 рази. Відновлення функціонування компонентів антиоксидантного захисту організму реалізується, напевно, через участь атому гідрогену поліфенолів екстракту в окиснювально-відновних реакціях. У сироватці крові спостерігали зниження активності маркерних ферментів цитолізу АлАТ в 1,5 рази, ферментів ЛФ та g-ГТП в 1,2 рази, ніж у щурів контрольної патології, що свідчить про регресію холестатичного та цитолітичного синдромів.
Рис.8. Вплив екстракту “Локорин” на перебіг тетрахлорметанового гепатиту щурів.
Примітки:
1.*- відмінність достовірна по відношенню до інтакту (р£ 0,05);
2.** - відмінність достовірна по відношенню до контрольної патології (р£ 0,05).
Гістологічні дослідження підтвердили гепатопротекторну дію екстракту “Локорин”, після введення якого значно поліпшився стан печінкової паренхіми. Він нормалізував структуру печінки на тлі активації клітинних і особливо внутрішньоклітинних регенеративних процесів.
При введенні тваринам референс-препарату силібору в дозі 25 мг/кг спостерігалися подібні зміни оксидативного балансу і позитивний його вплив на морфоструктуру печінки. Таким чином, в умовах гострого токсичного гепатиту екстракт “Локорин” чинив гепатозахисну дію, про що свідчать запобігання накопиченню продуктів пероксидації і розвитку синдрому цитолізу за рахунок як прямих, так і опосередкованих механізмів, а також мембраностабілізуючої дії.
Наступною моделлю, використаною для вивчення антиоксидантної дії екстракту “Локорин”, була модель ізадринового міокардиту. Міокардит характеризується розвитком ексудативних, проліферативних процесів та цитолізом кардіоміоцитів. У патогенезі цих змін відмічається активація процесів ПОЛ та виснаження АОС (Цубанова Н.А., 2004). Патологічні зміни в міокарді супроводжувались порушенням функцій серця, на що вказували показники ЕКГ: частота серцевих скорочень (ЧСС) носила характер тахі-брадиаритмії, мало місце пригнічення процесів збудження та провідності (збільшення тривалості шлуночкового комплексу Q-T), зростання амплітуд зубців Р і Т, спостерігали розвиток ішемії (відхилення ST від ізолінії).
Виживаність щурів в групі контрольної патології - 71%, коефіцієнт маси серця (КМС) зріс в 1,4 рази в порівняні з інтактними тваринами (рис. 9). В гомогенаті серця спостерігали підвищення вмісту ключових продуктів ліпопероксидації (ТБК-реактантів, ДК), в сироватці крові − гіперферментемію: АсАТ, КФК, ЛДГ, які є найбільш специфічними маркерами порушення окиснювального метаболізму у міокарді та розвитку дистрофічно-некротичних процесів (Резников К.М. и соавт., 1985). Одним з проявів кардіопротекторної дії екстракту „Локорин” в дозі 50 мг/кг був показник виживаності тварин, який зріс до 100%, а КМС зменшився в 1,3 рази. Мало місце достовірне зменшення концентрації продуктів ПОЛ, а також активності ЛДГ (в 1,5 рази), АсАТ (в 1,6 рази). Останнє може опосередковано свідчити про певні зміни в енергопостачанні міокарду. Позитивні зміни відмічались на ЕКГ та проявлялись зменшенням проявів ішемії.
Рис.9. Вплив екстракту “Локорин” на перебіг ізадринового міокардиту щурів.
Примітки:
1.*- відмінність достовірна по відношенню до інтакту (р£ 0,05);
2.** - відмінність достовірна по відношенню до контрольної патології (р£ 0,05);
3.*** - відмінність достовірна по відношенню до диклофенаку натрію (р£ 0,05).
Аналіз отриманих даних показав, що екстракт “Локорин” в цілому не поступається за кардіопротекторною дією диклофенаку натрію, а за деякими показниками (виживаність, зменшення вмісту ТБК-реактантів в 1,6 рази, ДК в 1,4 рази, активності АсАТ в 1,6рази, ЛДГ в 1,5 рази) навіть перевищує його. Виражена кардіопротекторна дія екстракту обумовлена наявністю у його складі флавоноїдів, оксикоричних кислот, кумаринів, дубільних речовин (Куцик Р.В., Зузук Б.М., 2002).
Однією з найголовніших характеристик субстанцій, які пропонують як перспективні для створення лікарських препаратів, є, поряд з вираженою фармакологічною активністю, їх безпечність. Отримані результати вивчення гострої токсичності при внутрішньошлунковому введенні щурам і мишам дозволили віднести досліджувану субстанцію до класу відносно нешкідливих речовин (ЛД50>15000 мг/кг) згідно з класифікацією токсичності речовин за Сидоровим К.К. (1973). При внутрішньоочеревинному введенні ЛД50 для мишей склала 4650 (3850-5460) мг/кг, для щурів − 4150 ( 3430-4880) мг/кг. Значення коефіцієнту видової чутливості, яке дорівнює 1,12, свідчить про її відсутність. Терапевтичний індекс екстракту “Локорин” складає більше 300, що характеризує значну широту терапевтичної дії і у 7 разів перевищує такий диклофенаку натрію. Екстракт “Локорин” не чинить ульцерогенної дії, не впливає на перистальтику кишечника та секреторну активність шлунка.
ВИСНОВКИ
1. У скринінгових дослідженнях показана висока протизапальна, анальгетична та жарознижувальна активність екстракту “Локорин”. ЕД50 за протизапальною активністю на моделі карагенінового набряку становила 50 мг/кг.
2. Установлені виражені протизапальні властивості екстракту “Локорин” на моделях гострого ексудативного запалення. Антиексудативна активність на моделі зимозанового набряку склала 59,9% і перевищувала таку на моделі гістамінового набряку. Екстракт “Локорин” виявляє антиліпооксигеназну активність, яка в 2 рази та 1,3 рази більша, ніж у диклофенаку натрію та кверцетину, відповідно. Протизапальний ефект обумовлений домінуючим впливом на пригнічення синтезу лейкотриєнів й помірним - на утворення ПГ. Висока антиексудативна активність екстракту (57,5%) у щурів з гострим перитонітом пов’язана з його можливістю перешкоджати деструкції клітинних мембран і гальмувати вивільнення маркерів інтоксикації.
0 комментариев