ПРИМЕНЕНИЕ

3. ПРИМЕНЕНИЕ

Иммуноанализ с подсчетом частиц находит все более широкое применение. Уже опубликовано более 80 работ, а также подробный обзор.

Некоторые вещества, определяемые с помощью иммуноанализа с подсчетом частиц

Определяемое вещество

Поливалентные антигены: Альфа-фетопротеин С-реактивный белок Ферритин Лактоферрнн S-100

Специфический гликопротеин на беременность

IgE

IgA

IgM

Подклассы IgG й IgA Тироксинсвязывающий глобулин Тироглобулин Тиротропный гормон Плацентарный лактогеи человека /J-Субъединица хориогоиадотропина человека /J-Микроглобулин Ретинолсвязьшающия белок Кансулярный антиген Н.influenzae Капсулярные антигены Streptococcus pneumoniae Антигены Streptococcus haemofyueus Моновалентные антигены:

Тироксин

Тринодтиронин

Дигоксин

Антитела: Ревматоидный фактор Блокирующие антитела против яда пчел Антитела против Brucella abortus Специфические антитела IgE Антитела против основного белка миелина Антитела против тироглобулина Антитела против столбняка Антитела против простого иируса герпеса типа 1

Иммунные комплексы:

Обнаружение с ревматоидным фактором

Обнаружение с мышиными Clq-ков, гаптенов, антител и иммунных комплексов, определяемых этим методом. В настоящее время тринадцать наборов реагентов для выполнения таких анализов производятся в промышленном маштабе и поступают в продажу.

4. НОВЫЕ ОБЛАСТИ ПРИМЕНЕНИЯ

В этом разделе будут рассмотрены не публиковавшиеся ранее результаты двух исследований, иллюстрирующие возможности и эффективность метода. Детали этих исследований будут вскоре опубликованы. В первом исследовании для изучения развития инфекции Brucella arbortus подопытных животных заражали этими организмами и забивали партиями по четыре мыши через определенные промежутки времени. Как показано на рис. 6, основным критерием развития инфекции может служить число образующихся колоний. Параллельно по степени ин-гибирующей активности определяли липополисахаридные антигены, а также циркулирующие иммунные комплексы и суммарное количество антител. Нетрудно видеть, что между CFU и количеством LPS-антигенов существует хорошая корреляция. Увеличение во времени концентрации антител и циркулирующих иммунных комплексов определяет иммунный статус. Эти исследования в настоящее время переносятся на крупный рогатый скот и на человека с тем, чтобы результаты можно было использовать в диагностике и при лечении.

Во втором исследовании показана возможность применения метода для измерения очень низких концентраций белков. В тиро-идной эндокринологии постоянно ощущается потребность в высокочувствительных методиках определения тироидстимулирующего гормона. Такие методики позволяли бы надежно отличать больных тиротоксикозом, а также микседемой от здоровых людей. Более того, при острых эутотироидных синдромах такие методики менее проблематичны, чем определение свободного тироксина, поскольку на их результаты не влияют посторонние вещества, часто присутствующие в сыворотке больных, страдающих этими заболеваниями.

На рис. 8 представлена схема первого гомогенного высокочувствительного метода определения TSH; благодаря одночасовой инкубации это самый быстрый из описанных до настоящего времени методов определения TSH в сыворотке человека. В нем используются два типа моноклональных антител на различных латексах. Предел обнаружения и калибровочная кривая представлены на рис. 9.

Предварительные результаты исследования сыворотки группы здоровых людей и группы больных тиротоксикозом представлены на рис. 10. Результаты анализа позволяют четко различить эти две группы. В гипертироидной группе оказался один пациент с Т₃-токсикозом, у которого концентрация TSH превысила предел обнаружения. Тироидный статус этого пациента точно неизвестен.

Аналогичные результаты определения TSH позднее были получены методом радиоиммуноанализа с набором реагентов Behring HS-TSH. Вероятно, этот пациент ошибочно был включен в группу больных тиротоксикозом.

5. ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ МЕТОДА

Из приведенных выше данных видно, что определение TSH в сыворотке человека с помощью метода IMPACT позволяет в 10 -1000 раз повысить чувствительность по сравнению с турбидимет-рическим иммуноанализом с латексной агглютинацией. По чувствительности описанный метод сравним с иммунорадиометрическим анализом и превосходит флуоресцентный, хемилюминес-центный или ферментный иммунометрические методы анализа.

Как показано на рис. 11, в методе IMPACT -используется избыток антител. Однако по своим характеристикам метод IMPACT располагается скорее между собственно иммунометриче-скими методами и конкурентным иммуноанализом, причем связывание антигена с антителом, возможно, усиливается за счет множества слабых взаимодействий.

Физические основы метода сложны и пока еще не до конца изучены. Чувствительность анализа определяется: 1) числом частиц, 2) поверхностной плотностью антител или антигена, 3) константой связывания антител, 4) возможно, псевдоконстантой связывания антител, 5) погрешностью Пуассона при подсчете частиц в потоке, проходящем через ячейку.

Чувствительность метода можно увеличить примерно в 100 раз, если подсчитывать агглютинированные частицы. При этом должна также устраняться компонента погрешности Пуассона, обусловленная фоном неагглютинированных частиц. Подсчет агглютинированных частиц довольно сложен. Относительное содержание определяемых димеров, тримеров, тетрамеров и высших олиго-меров зависит от природы изучаемого вещества и от его концентрации. Прототип детектора с высокой разрешающей способностью разработан фирмой Acade Diagnostic Systems и предназначен для определения альфа-фетопротеина методом IMPACT. Для решения проблемы сложного характера агглютинации детектор, функционируя в кинетическом режиме, определял только димер. Таким путем всего за 4 мин удалось с высокой чувствительностью определить концентрацию димера прежде, чем успели образоваться заметные количества высших олигомеров.

6. ПЕРСПЕКТИВЫ РАЗВИТИЯ

Система IMPACT находится в такой стадии развития, когда уже создана прочная основа для дальнейшего совершенствования путем расширения круга определяемых веществ и разнообразия методик. В этом контексте вырисовываются три основных пути развития системы: 1) определение новых веществ, 2) совершенствование химических процессов, 3) совершенствование приборов.

Определение новых веществ. Широкая сфера применения метода позволяет использовать его для определения практически любого нового вещества. В настоящее время разрабатываются методики определения антигенов вируса иммунного дефицита человека и антител к нему, факторов коагуляции, специфических аллергенов. Пока еще не изучалась возможность определения веществ с помощью специфических связывающих белков, а не антител. В принципе систему IMPACT можно использовать и для определения веществ с помощью таких связывающих белков.

Совершенствование иммунохимических процессов. Применение моноклональных антител, например при определении TSH, повышает специфичность. Устранить побочные эффекты, связанные с избытком антигена, можно путем соответствующего картирования эпитопов. Ожидается, что метод может найти применение и в молекулярной биологии.

Совершенствование приборов. В середине 1987 г. фирмой Acade Diagnostic System S.A. начат выпуск новой компактной модульной полуавтоматической системы MULTIPACT. Она состоит из высокопроизводительного счетчика частиц, термостата и устройства для добавления и разбавления проб и растворов реагентов. Будут выпускаться также наборы реагентов для определения следующих 6 веществ: Т₄, Т₃, тирок-синсвязывающего глобулина, TSH, дигоксина и c-hCG. В наборах для определения TSH и /?-hCG используются моноклинальные антитела.

Аналогичные системы третьего поколения, вероятно, будут обладать большей производительностью, способностью быстро работать в кинетическом режиме и определять агглютинированные частицы.

ВЫВОДЫ

После сравнительно длительного периода становления иммуноанализ с подсчетом частиц достиг такого состояния, когда 1) его чувствительность не уступает чувствительности других лучших конкурентных методов иммуноанализа, 2) на результаты анализа почти не влияют никакие посторонние вещества в пробе, 3) по производительности, дешевизне и степени автоматизации он не имеет себе равных.

Современная промышленность способна производить дешевые полуавтоматические приборы, предназначенные для проведения анализов в небольших лабораториях, а также полностью автоматизированные, быстродействующие анализаторы для крупных клиник или контрольных лабораторий. Более того, отдельные операции могут найти применение и в других системах, например в автоматических клинических анализаторах, работающих на принципе регистрации кинетики турбидиметрии. Представляется вполне вероятным, что система IMPACT или какой-либо ее аналог сыграют одну из важнейших ролей при переходе к методам иммуноанализа без применения радиоактивных изотопов как в клинической диагностике, так и в научных исследованиях.