Окисно-відновні процеси в статевих клітинах бугаїв і корів, способи оцінювання якості та підвищення запліднюваності

Львівський національний університет

ветеринарної медицини та біотехнологій

імені С. З. Ґжицького

Остапів Дмитро Дмитрович

УДК: 636.2:631.147.611-013.11

ОКИСНО-ВІДНОВНІ ПРОЦЕСИ В СТАТЕВИХ КЛІТИНАХ БУГАЇВ І КОРІВ, СПОСОБИ ОЦІНЮВАННЯ ЯКОСТІ ТА ПІДВИЩЕННЯ ЗАПЛІДНЮВАНОСТІ

 

03.00.13 – фізіологія людини і тварин

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора сільськогосподарських наук

Львів – 2008

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті біології тварин Української академії аграрних наук, м. Львів.

Науковий консультант: доктор біологічних наук, професор

Чухрій Борис Миколайович,

Інститут землеробства і тваринництва західного регіону УААН,

головний науковий співробітник лабораторії відтворення стада.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

Смолянінов Борис Вікторович,

Одеський державний аграрний університет,

завідувач кафедри фізіології та біохімії сільськогосподарських тварин;

доктор сільськогосподарських наук, професор,

академік УААН Безуглий Микола Дмитрович,

віце-президент Української академії аграрних наук;

доктор ветеринарних наук, професор, член-кореспондент УААН Косенко Михайло Васильович, Державний науково-дослідний інститут ветеринарних препаратів і кормових добавок,

заступник директора по організаційно-інформаційній роботі, завідувач відділом контролю якості ветеринарних препаратів при незаразних захворюваннях тварин.

Захист дисертації відбудеться ”17 ” червня 2008 р. о 12 год на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 35.826.01 у Львівському національному університеті ветеринарної медицини та біотехнологій імені С. З. Ґжицького за адресою: 79010, м. Львів, вул. Пекарська, 50, аудиторія №1.

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Львівського національного університету ветеринарної медицини та біотехнологій імені С. З. Ґжицького за адресою: 79010, м. Львів, вул. Пекарська, 50.

Автореферат розісланий ” 14 ” травня 2008 р.

Вчений секретар спеціалізованої

вченої ради, доктор ветеринарних наук, професор П. І. Головач

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Дослідженнями доведені відмінності у корів заплідненості, фізіологічних, морфологічних ознак ооцитів, у плідників – показників якості еякулятів, життєздатності сперміїв (Сірацький Й.З., 1992; Яблонський В.А. та ін., 1994; Гузеватий О.Є та ін., 1995; Krisher R.L., Bavister B.D., 1999; Безуглий М. Д. та ін., 2000; Косенко М.В. та ін., 2005, 2007). У зв’язку з вказаним, важливого значення набуває розробка методів оцінювання фізіологічного стану статевих клітин, корекції їхнього метаболізму для підвищення запліднення in vivo та in vitro.

Серед маркерів відтворної функції самок і самців важливим є кисень-залежні процеси (Dalvit G. C. et al., 1995; Van Blerkom J. et al., 1997; Geshi M. et al., 2000). За певних обставин, вони забезпечують ресинтез АТФ і свідчать про запліднюючу здатність сперміїв (Звєрєва Г.В. та ін., 1989), визначають розвиток кумулюсного оточення та дозрівання ооцитів (Смирнова Т.А., Галиева Л.Д., 1998), індукують капацитацію сперміїв (Leclerc P. et al., 1996; Mankovska І.M., Serebrovska Z.O., 1998; Дутчак В.О. та ін., 2001), за інших – пригнічують синтез АТФ, активність ферментів, порушують цілісність клітинних мембран, знижують рухливість сперміїв, призводять до сповільнення мейозу (Atreja S.K. et al., 1997; Therien I. et al., 1998; Vorup-Jensen T. et al., 1999; Kim J.Y. et al., 2001). Рівновагу між окисними та відновними процесами забезпечують відповідні ферменти та антиоксиданти, зокрема, глутатіон і аскорбінова кислота, вміст яких в еякулятах впливає на життєздатність, стійкість до заморожування та запліднюючу здатність сперміїв, у фолікулах – компактність кумулюсу, дозрівання ооцитів, виживання та розвиток ембріонів in vitro (Slаweta R., Liaskowska Т., 1987; Jain M. C., Arora N., 1988; Yoshida M., 1993; Kodaman P. H., Behrman H. R., 1999; Murray A.A. et al., 2001, Смолянінов Б. В., Кротких М. А., 2004). Отже, вивчення окисно-відновних процесів забезпечить встановлення оптимальних величин їх активності, виявлення біохімічних маркерів фізіологічного стану статевих клітин самців і самок, підвищення результатів штучного осіменіння корів та репродуктивної біотехнології, розроблення способів оцінювання якості і запліднювальної здатності сперміїв, ефективності вирощування ембріонів великої рогатої худоби in vitro. Поглиблені знання з фізіології статевих клітин самців і самок виявлять фактори впливу на якість сперміїв та ооцитів, забезпечать оцінювання, відбір та прискорене накопичення високопродуктивного генетичного потенціалу для створення нових генотипів тварин.

Зв’язок з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконувалась в Інституті біології тварин УААН та Інституті землеробства і тваринництва західного регіону УААН за завданнями ”Оцінка і прогнозування репродуктивної функції великої рогатої худоби за генетичними маркерами” (№ держреєстрації UA 01001641), „Розробити наукові основи підвищення репродуктивної функції корів і бугаїв новостворених генотипів чорно-рябої породи” (№ держреєстрації U 024406).

Мета і завдання досліджень. Мета роботи полягала у вивченні ролі окисно-відновних процесів у еякулятах бугаїв і фолікулах яєчників корів, їх впливу на капацитацію та дозрівання сперміїв і ооцитів поза організмом, розробленні способів корекції метаболізму статевих клітин, оцінювання їх фізіологічного, морфологічного стану і придатності для використання у практиці штучного осіменіння та репродуктивній біотехнології, підвищення запліднюючої здатності сперміїв, заплідненості ооцитів in vivo та in vitro.

Для реалізації мети вирішували наступні завдання:

1.          З’ясувати роль окисно-відновних та синтетичних процесів у статевих клітинах і еякулятах бугаїв, кореляції між біохімічними показниками та їх вплив на фізіологічні показники сперміїв. Розробити спосіб оцінювання якості та запліднюючої здатності сперміїв за інтенсивністю дихання і активністю окисних ферментів іn vivo та іn vitro.

2.          Встановити значення окисно-відновних процесів у сперміях бугаїв за дії факторів капацитації та антиоксидантів. Розробити способи оцінювання капацитації сперміїв, підвищення їх життєздатності і запліднюючої здатності після кріоконсервації.

3.          Вивчити окисно-відновні процеси у фолікулах яєчників корів, вплив біохімічних показників на якість яйцеклітин. Розробити спосіб оцінювання якісних характеристик ооцитів іn vitro.

4.          З’ясувати окисно-відновні та синтетичні процеси в ооцитах за дії субстратів ланцюга дихання та при культивуванні у синтетичних середовищах, удосконалити методи вирощування ембріонів корів in vitro.

5.          Визначити інтенсивність окисно-відновних та синтетичних процесів у ембріонах корів при інкубації у поживних середовищах.

Об’єкт дослідження: фізіолого-біохімічні процеси в еякулятах і сперміях бугаїв, фолікулах яєчників, ооцитах та ембріонах корів.

Предмет досліджень: сперма бугаїв свіжоотримана і розморожена, спермії, яєчники, клітини гранульозного шару фолікулів, ооцити та ембріони корів.

Методи дослідження: фізіологічні, біохімічні, цитоморфологічні, біотехнологічні, статистичні.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше доведено роль окисно-відновних процесів у забезпеченні високих значень фізіологічних показників і запліднювальної здатності сперміїв бугаїв in vivo та in vitro, дозріванні ооцитів, їх заплідненні та розвитку ембріонів корів in vitro. Вивчено перебіг і регуляцію окисно-відновних процесів при капацитації сперміїв та дозріванні ооцитів і, після їх запліднення, росту ембріонів. Встановлено фактори оптимальної рівноваги між процесами окиснення і відновлення у статевих клітинах та маркери їх інтенсивності. Вперше в спермі бугаїв установлено оптимальні рівні інтенсивності окисно-відновних процесів, межі яких забезпечують високі фізіологічні показники і запліднюючу здатність сперміїв у свіжоотриманих і розморожених еякулятах. Вивчено вплив аскорбінової кислоти і відновленої форми глутатіону на енергетичний та міжклітинний обмін, значення для фізіологічного стану сперміїв, характеристики напруженості окисних процесів та ефективність впливу антиоксидантів у розріджувачі сперми на запліднюючу здатність. Доведено вплив окиснення субстратів розріджувача та середовищ культивування на фізіологічний стан сперміїв і клітин гранульози, дозрівання ОКК, запліднення і розвиток ембріонів in vitro. Встановлено зв’язок капацитації сперміїв бугаїв з придатка сім’яника зі споживанням кисню, відновною здатністю, активністю сукцинатдегідрогенази (СДГ) і глюкозо-6-фосфатдегідрогенази (Г-6-ФДГ), вмістом білків, морфологічними змінами в акросомі. Вивчено в яєчниках у зв’язку з їх фізіологічним станом динаміку антиоксидантів, білкових фракцій і глікопротеїнів, вплив на інтенсивність фолікуло- та оогенезу, якість ооцитів і придатність для використання в репродуктивній біотехнології; інтенсивність процесів окиснення і відновлення в ембріонах у зв’язку зі стадіями розвитку.

Практичне значення отриманих результатів. Удосконалені способи оцінювання якості еякулятів бугаїв („Спосіб визначення кількості живих сперміїв у еякулятах бугаїв”), підвищення стійкості сперміїв до факторів зовнішнього впливу („Спосіб захисту сперміїв бугаїв при заморожуванні”), оцінювання якості та запліднюючої здатності сперміїв за активністю ферментів дихального ланцюга („Спосіб визначення сукцинатдегідрогенази в спермі бугаїв”). Способи оцінювання якості сперміїв бугаїв включені у довідник „Фізіолого-біохімічні методи досліджень у біології, тваринництві та ветеринарній медицині” (2004). Розроблено середовище, що забезпечує високу ефективність вирощування ембріонів корів поза організмом („Середовище для вирощування зигот корів ранніх стадій in vitro”). Матеріали дисертаційної роботи увійшли до методичних рекомендацій ”Способи оцінювання якості еякулятів бугаїв та підвищення запліднювальної здатності сперміїв”, СОУ 1.42-37-6171: 2007 ”Велика рогата худоба. Оцінювання якості еякуляту і запліднювальної здатності сперміїв бугаїв”.

Способи використані племпідприємствами для визначення якості та запліднюючої здатності сперми бугаїв, а капацитації сперміїв й високоефективне середовище вирощування ембріонів іn vitro – для наукових досліджень та практичних робіт з отримання ембріонів великої рогатої худоби поза організмом.

Основні положення дисертаційної роботи впроваджені у навчальний процес Львівського національного університету ветеринарної медицини та біотехнологій імені С. З. Ґжицького, Сумського національного аграрного університету,

Харківської державної зооветеринарної академії Міністерства аграрної політики України, Львівського національного університету імені Івана Франка.

Особистий внесок здобувача. Автором самостійно розроблено науково-дослідну програму, проведено експериментальні дослідження, аналіз першоджерел літератури, розроблено теоретичне обґрунтування з відбору та оцінювання якості статевих клітин бугаїв і корів, механізмів капацитації сперміїв, оогенезу та ембріогенезу в корів, зроблені фотографії сперміїв, ооцитів і ембріонів, відзняті процеси капацитації сперміїв, запліднення і розвитку ембріонів корів. Проведено статистичний аналіз отриманого цифрового матеріалу, опубліковані результати досліджень. За участю наукового консультанта розроблено схему й методичні підходи проведення досліджень.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації і результатів досліджень апробовані і схвалені на міжнародних та республіканських науково-практичних конференціях і з’їздах: “Всеукраїнській конференції з фізіології і біохімії тварин, присвяченої 35-річчю Інституту фізіології і біохімії тварин та 95 -річчю від дня народження засновника інституту, академіка УА СГН, заслуженого діяча науки України, професора Ґжицького С. З.” (Львів, 1995), “Актуальні проблеми розвитку сучасної зооветеринарної науки”, (Львів, 2001), “Здобутки і перспективи ветеринарного акушерства” (Львів, 2002), “Актуальні проблеми розвитку тваринництва” (Львів, 2003), “Біологічні основи продуктивності та здоров’я тварин” (Львів, 2006), “Тваринництво XXI сторіччя: новітні технології, досягнення та перспективи” (Харків, 2006), “Механізми функціонування фізіологічних систем (Львів, 2006), “Сучасні методи репродукції сільськогосподарських тварин: стан і перспективи розвитку” (Харків, 2008).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 45 наукових праць, з яких 30 статей, СОУ 1.42-37-6171 : 2007 ”Велика рогата худоба. Оцінювання якості еякуляту і запліднювальної здатності сперміїв бугаїв”, методичні рекомендації, 9 публікацій у матеріалах конференцій та отримано 4 патенти на винахід.

Структура і обсяг роботи. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, матеріалів і методів досліджень, 4 розділів власних досліджень, висновків і практичних пропозицій, додатків, списку джерел літератури, який включає 867 назв, з них 756 іноземних. Текст викладений на 359 сторінках комп’ютерного варіанту, включає 17 рисунків і 72 таблиці.

Умовні позначення: СС – суспензія сперміїв; СМ – слизова матки корови; СК – суспензія клітин; БСА – альбумін сироватки крові бугая; ФР – фолікулярна рідина; ГП – гепарин; АМП – амідопірин; т-БГП – т-бутилгідроперекис; МДА – малоновий діальдигід; Г-SH – відновлена форма глутатіону; АА – аскорбінова кислота; ММ – молекулярна маса.

Основний зміст роботи

 

Огляд літератури складається з 5 розділів у яких наведені дані з характеристики фізіологічних показників та інтенсивності окисно-відновних процесів у еякулятах бугаїв та фолікулах яєчників корів, сперміях і ооцитах при підготовці і використанні їх у штучному осіменінні та репродуктивній біотехнології, впливу природних антиоксидантів та умов культивування на запліднюючу здатність сперміїв, запліднення ооцитів і розвиток ембріонів.

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

 

Дослідження виконано протягом 1994–2005 років в Інституті біології тварин УААН та Інституті землеробства і тваринництва західного регіону УААН, Львівському, Сокальському, Судово-Вишнянському, Дрогобицькому племпідприємствах, м’ясопереробних підприємствах: „Прикарпаття” та „Галев-Ресурс”.

Досліджували, отриману на штучну вагіну, сперму 72 бугаїв у віці 2–9 років (порід: української чорно-рябої молочної, німецької, голландської, голштинської чорно-рябої, британо-фризької) систематично з інтервалом 10–14 днів. Визначали у свіжоотриманих еякулятах – об’єм (мл), рухливість сперміїв (активність, бали), концентрацію (10⁹ клітин/мл) та кількість живих (%; Яблонський В. А., 1962), виживання при температурі + 46,5°С (хв; Рослановський П., 1962) після розбавлення 1 : 10 розріджувачем для заморожування сперми в облицьованих гранулах; резистентність (тис; Смирнов І. В. , 1976); у розмороженій спермі – виживання сперміїв (хв) при температурі +38,0°С. Спермії з придатка сім’яника отримували після забою бугаїв у віці 10–8 міс через надріз стінки каналу придатка з наступним вимиванням 2,8%-ним розчином натрію цитрату чи 0,9%-ним натрію хлориду. У суспензії сперміїв (СС) визначали концентрацію (10⁹ клітин/мл) підрахунком у камері Горяєва, рухливість – візуально, під мікроскопом, активність СДГ (мкМ/хв/л; Чухрій Б. М. та ін., 1995), цитохромоксидази (ЦХО; мкМ/хв/л; Чухрій Б. М., Клевець Л.О., 1978); вміст аскорбінової кислоти та продуктів окиснення (дегідроаскорбінову і дикетогулонову кислоти; мкг/мл; Климов А. М., 1956), дихальну активність – полярографічно (нг-атом О/0,1мл СС/хв); відновну здатність – потенціометрично (фериціанід калію – 10^-4М; мкг перетвореного К₃[Fe(СN)₆] (мкг К₃...)/0,1мл СС/хв; Штольц К.Ф. та ін., 1980). Інтенсивність дихання та відновну здатність сперміїв досліджували при температурі +38,5°C у фосфатно-сольовому буфері (ФСБ; NaCl–0,8г, KCl–0,02г, Na₂HPO₄–0,11г, KH₂PO₄–0,02г, MgCl₂–0,01г, Н₂О до 100 мл). Для вивчення окисно – відновних процесів у статевих клітинах бугаїв та впливу чинників капацитації отриману з придатка сім’яника СС, оцінених за рухливістю, зберігали 6–8 год при температурі 0 – +4°С з наступним інкубуванням 30, 60 і 120 хв (температура +38,5°С) у середовищах капацитації: контрольному – ФСБ та дослідних – ФСБ з додаванням: гомогенату слизової матки корови (СМ; яєчник зі ”свіжою овуляцією” – на місці фолікула утворився згусток крові); фолікулярної рідини (ФР; не інактивована, отримана аспірацією з фолікула діаметром більше 1,5 см, 20% концентрація у пробі); гепарину (ГП, 200 од/мл); 0,1% розчину БСА зі 150 мМ натрію хлориду; амідопірину (АМП, 4Ч10^-3М); перекису водню (Н₂О₂; 1%-ний розчин). Досліджували: стан акросоми сперміїв (Gross N.L., Meizel S., 1989), інтенсивність поглинання кисню та відновну активність без- та за наявності інгібіторів. Використані інгібітори: гліколізу – натрій фторид (NaF; 10^–3M); ланцюга дихання мітохондрій: НАД-залежної ланки – амітал (АМ; 5Ч10^-3М) і термінальної (цитохромоксидази) – натрію азид (NаN₃; 5Ч10^–2M). Вільнорадикальне окиснення ненасичених жирних кислот, яке супроводжується споживанням кисню, інгібували NаЕДТА (6Ч10^-4М; Орехович В.Н., 1977). При цьому, різницю між споживанням кисню чи відновною активністю до- та після додавання інгібітора вважали часткою біохімічного процесу, відповідно, у реалізації кисню та постачанні відновних еквівалентів у позаклітинний простір. Енергетичні потреби сперміїв забезпечували фруктозою (20мМ), піруватом, сукцинатом, глутаматом, a-кетоглутаратом (б–КГ), малатом (по 10^-2М). Активність Г-6-ФДГ ( мкМ НАДФН /мл/хв; Farnararo M. et al., 1978, Gruceanu A., Bucsa L., 1979 ) та СДГ визначали за наявності фолікулярної рідини та гепарину, після інкубації 120 хв при +38°С. Спектр білків у процесі виживання сперміїв (при температурі +46,5°С) і після зберігання (при температурі 0 – +4°С) вивчали електрофорезом у поліакриламідному гелі (ПААГ; 7,5% та 12,5% з 0,1%-ним вмістом натрію додецилсульфату) у еякулятах та СС. Ідентифікували окремі білки за допомогою відповідних маркерів з молекулярними масами (ММ): 94,0; 67,0; 43,0; 30,0; 20,1; 14,4 кДа (LMW; Pharmacia, Швеція).

Вплив антиоксидантів на окисно-відновні процеси в еякулятах, вивчали у ФСБ при додаванні глутатіону (відновлена форма, Г-SH; 3Ч10^-3М) і аскорбінової кислоти (АА; 5Ч10^-3М) та моделюванні ”окисного навантаження” (т- бутилгідроперекис; т-БГП, 10^-3М) за наявності субстратів: фруктози, пірувату, б-КГ, сукцинату і лактозо-жовтково-гліцеринового розріджувача сперми (ЛЖГ-cредовище) на дихальну та відновну активності сперміїв без- та з використанням інгібіторів. Вплив Г-SH і АА вивчали в еякуляті розділеному на частини – контрольну (ЛЖГ- cередовище) і дослідні – ЛЖГ-cередовище з додаванням: АА (2,50; 5,0; 10,0 мМ); Г-SH (2,50; 5,0; 10,0 мМ) та поєднання АА+Г-SH (1,25+1,25; 1,25+2,5; 2,50+2,50; 5,0+5,0 та 10,0+10,0 мМ). Досліджували у свіжоотриманій і розмороженій спермі інтенсивність поглинання кисню і відновну здатність, активність СДГ і ЦХО, вміст малонового діальдигіду (МДА; Tappel A. L., Zalkin H., 1959), рухливість, виживання і резистентність статевих клітин. Для штучного осіменіння корів використовували сперму бугаїв Контакта 1375 і Ринка 2919. Кожен еякулят розділяли на дві частини, контрольну (без антиоксидантів) і дослідну (з антиоксидантами). Ефективність доданих антиоксидантів у розріджувачі визначали обліком результатів штучного осіменіння корів-аналогів.

Відбір яєчників корів за ооцитпродуктивністю, вивчення окисних процесів у фолікулах та ооцитах проводили після оцінювання їх фізіологічного стану: “фолікулярного зростання”, без жовтого тіла; зі ”свіжою” овуляцією, на місці фолікула утворена порожнина, жовте тіло відсутнє або діаметром до 0,5см, червоного кольору; з “раннім” жовтим тілом, діаметром 1,0–2,0см, червоного або брунатного кольору; з “пізнім” жовтим тілом, діаметром 0,5–1,5см, жовтого кольору. Для досліджень використовували яєчники корів з фолікулами діаметром до 4мм (малі), 4–7мм (середні) і більше 7мм (великі).

Антральну рідину (фолікулярна рідина + клітини гранульозного шару фолікулів + ооцити), отримували методом аспірації фолікулів. У ній визначали кількість клітин гранульозного шару – підрахунком в камері Горяєва (10⁶ клітин/мл) та ооцитів – оцінювали стан кумулюсу (без кумулюсу – “голі”; з розпушеним або частково втраченим; з компактним багатошаровим) і поміщали в чашки Петрі з середовищем культивування. В антральній рідині фолікулів вивчали активність Г-6-ФДГ, вміст аскорбінової кислоти та продуктів окиснення її і глутатіону (мг%; Чулкова М. С., 1955). Для вивчення локалізації антиоксидантів антральну рідину ділили на частини – в одній визначали їх вміст, іншу центрифугували при 600 g 15 хв, супернатант відділяли, а осад суспендували в адекватному об’ємі 0,9 %-ного натрію хлориду. Процедуру повторювали двічі. Антиоксиданти визначали у супернатанті (фолікулярній рідині) та суспендованому осаді (клітинах гранульозного шару фолікулів). Крім цього, у фолікулярній рідині вивчали вміст загального білка (г%) біуретовою реакцією, фракції білків елекрофорезом в 7,5% ПААГ (%) та глікопротеїнів (%; реактивом Шиффа). Клітини гранульозного шару фолікулів суспендували в середовищі RPMI-1640 (Flow Laboratories) і вивчали інтенсивність поглинання кисню (нг-атом О/0,1мл суспензії клітин (СК)/хв); відновну активність (мкг К₃…/мл СК/хв) без- та з інгібіторами. НАДН-редуктазні процеси стимулювали НАДН (10^-3М), вільнорадикальне окиснення жирних кислот гальмували NaEДTA (6Ч10^-4М).

Для дозрівання ооцити інкубували в чашках Петрі з середовищами культивування клітин: ТС 199, Іґла (Sigma), RPMI-1640. До середовищ додавали: 10% фолікулярної рідини (не інактивована, отримана аспірацією з фолікула діаметром більше 1,5 см), 10% фетальної сироватки, 10% еструсної сироватки крові корів, клітини гранульози (5–7Ч10⁶/мл з антральних фолікулів діаметром до 4 мм без ознак атрезії), 0,03% інсуліну (0,13 од/мл), 0,001% гепарину (5 од/мл). Ооцити культивували в герметично закритому ексикаторі 16–18 год за максимальної вологості, вмісту СО₂ 5,0% і температури 38,5°С, рН середовища 7,2–7,4.

Запліднювали ооцити in vitro сперміями з придатка сім’яника, після капацитації у фолікулярній рідині (0,1мл СС; 12,0–15,0Ч10⁶ /мл з активним прямолінійним рухом), які вносили в чашки Петрі до ооцитів проінкубованих 16–18 год.

Для вивчення інтенсивності окисних процесів у ембріонах, після 16–18 год спільного культивування ооцитів зі сперміями, ембріони переносили в середовища культивування: ТС 199, Іґла, RPMI-1640, які додатково містили 10% гомогенату слизової з верхньої третини рогів матки корів. Культивували в герметично закритому ексикаторі при максимальній вологості, температурі 38,5°С, 5% СО₂. Середовище замінювали через кожні 48 год культивування.

У свіжоотриманих і збережених (24 год) ооцитах, визначали інтенсивність поглинання кисню (нг-атом О/ооцит/хв) та відновну активність (пкг К₃.../ооцит/хв) при використанні субстратів – ендогенних (ФСБ Дюльбеко) і екзогенних: сукцинату (10^-2М), АТФ (5Ч10^-6М), середовищ культивування клітин (ТС 199, Іґла, RPMI-1640). Для виявлення залежності між інтенсивністю поглинання кисню, зовнішньоклітинним транспортом електронів та часткою ланок дихального ланцюга в реалізації кисню за наявності ендо- та екзогенних субстратів використовували інгібітори: гліколізу (NaF; 10^-3М); НАДН-залежної ділянки дихального ланцюга (амітал; 5Ч10^-3М); термінальної (NaN₃; 5Ч10^-2М); вільнорадикальне окиснення жирних кислот гальмували NaEДTA (6Ч10^-4М).

У ембріонів різних стадій розвитку визначали дихальну і відновну активність у середовищах – ФСБ Дюльбеко і RPMI-1640. Для встановлення залежності між інтенсивністю поглинання кисню, зовнішньоклітинним транспортом електронів та часткою ланок дихального ланцюга в реалізації кисню використовували інгібітори: гліколізу (NaF; 10^-3М); НАДН-залежної (амітал; 5Ч10^-3М) та термінальної (натрію азид; 5Ч10^-2М) ділянок дихального ланцюга, вільнорадикальне окиснення жирних кислот гальмували NaEДTA (6Ч10^-4М).

Матеріал документували мікрофотографіями. Статистичний аналіз отриманих результатів проведено за Плохінським М. О. (1969) з використанням комп’ютера та розроблених програм (програмне забезпечення Clipper).

 

Результати Власних досліджень та їх аналіз

 

Інтенсивність окисно-відновних процесів у спермі бугаїв

Сперма бугаїв характеризується високою інтенсивністю окисно-відновних процесів. Так, дихальна активність сперміїв становить 17,8±0,55 нг-атом О/10⁸сперміїв/хв, швидкість відновлення калію фериціаніду – 8,6±0,97 мкг К₃…/10⁸сперміїв/хв, активність СДГ – 11,2±0,21 і ЦХО – 33,1±0,37 мкМ/хв/л, вміст аскорбінової кислоти – 37,3±3,51 мкг/мл, окиснених продуктів – 10,7±1,08 мкг/мл, загальний вміст 47,7±3,31 мкг/мл; відношення окремих складових до загального вмісту, відповідно, 78,2 : 22,4 (табл. 1). Вміст альбуміну 16,9±1,00%, глобулінів: a- 30,6±2,17%, b- 15,7±0,93%, g- 30,6±1,55%. При високих середніх значеннях, встановлено значні коливання величин досліджених біохімічних показників. Так, коефіцієнт варіації споживання кисню і аскорбінової кислоти та їх компонент становить більше 50%, активності ферментів від 30 до 50%, відновної здатності – 20,9%.

Таблиця 1

Характеристика біохімічних показників еякулятів бугаїв

Досліджувані показники		n	M ± m	CV	lim
Споживання кисню, нг-атом О/ 108 сперміїв / хв: спермою		187	17,8 ± 0,55	59,1	5,3 – 60,7
в тому числі: мітохондріальне		187	9,4 ± 0,39	55,8	4,1 – 32,8
азидрезистентне		186	10,9 ± 0,56	70,1	1,3 – 27,2
Відновна активність, мкг К3…/108 сперміїв/хв		118	8,6 ± 0,97	20,9	0,1 – 26,0
Активність СДГ, мкМ/хв/л		661	11,2 ± 0,21	48,5	0,5 – 55,0
Активність ЦХО, мкМ/хв/л		678	33,1 ± 0,37	29,3	0,5 – 100,0
Вміст, мкг/мл:	аскорбінової кислоти	280	37,3 ± 3,51	69,7	5,0 – 110,0
	окиснених продуктів (дегідроаскорбінової і дикетогулонової кислот)	280	10,7 ± 1,08	90,7	0,5 – 45,0
	загальний (аскорбінової кислоти + окиснених продуктів)	280	47,7 ± 3,31	52,6	5,0 – 150,0

Фактори впливу на інтенсивність окисно-відновних процесів у еякулятах бугаїв

Мінливість наведених показників зумовлена зрілістю сперміїв в еякуляті, індивідуальними особливостями плідників, що залежить від генетичних факторів, відмінністю першого і другого еякулятів, отриманих у той самий день та різні. Спермії отримані з придатка сім’яника, порівняно з еякульованими, характеризуються нижчими значеннями споживання кисню на 73,2% та відновної здатності на 95,0%. Від загальної кількості спожитого кисню аеробний гліколіз займає у сперміях з придатка сім’яника 16,7%, еякульованих – 48,1%, активність НАД-залежної ланки дихального ланцюга, відповідно, 41,6% і 34,0% та термінальної (ЦХО) у перших – не змінюється, других – 8,0%.

За дихальною активністю різниця між першим і другим еякулятами становить 42,8%, її мітохондріальною та азидрезистентною компонентами, відповідно, 71,5 і 24,6%, активністю СДГ і ЦХО – 82,0 і 77,8%, вмістом аскорбінової кислоти – 66,7%, продуктами окиснення не відрізняються, а за загальним вмістом – 40,0%. За фізіологічними показниками еякуляту різниця становить: об’ємом – 33,4%, концентрацією та кількістю живих сперміїв, відповідно, 44,5 та 19,1%.

При дослідженні сперми бугаїв у різні дні найбільша різниця виявлена за активністю СДГ та вмістом аскорбінової кислоти – 100,0%, споживанням кисню, в тому числі, мітохондріальним та азидрезистентним – 58,6–61,0%, окисненими продуктами аскорбінової кислоти та активністю ЦХО – 50%. Коливання фізіологічних показників становлять: об’єму еякуляту 15,3–25,0%, концентрації сперміїв 25,0–80,0%, кількості живих 8,0–27,1%.

Різниця за індивідуальними особливостями бугаїв становить: споживання кисню сперміями у еякуляті – 42,0%, його мітохондріальною і азидрезистентною компонентами, відповідно, 38,7 і 46,0%, активності СДГ та ЦХО – 12,5 та 8,1%, вмісту аскорбінової кислоти – 67,8% (р<0,01), окиснених продуктів – 50,9% (р<0,05). За фізіологічними показниками еякулятів, а саме, об’ємом на 22,4%, концентрацією сперміїв – 7,8%, кількістю живих – 4,7%.

Біохімічні показники сперми змінюються в залежності від сезону року і, навесні проявляються низькі значення споживання кисню (нг-атом О/10⁸ сперміїв/хв) 16,3±0,81, мітохондріального і азидрезистентного дихання – 7,6±0,48 і 8,7±0,46, активності СДГ 10,8±0,41, ЦХО 31,6±0,76 мкМ/хв/л. Влітку величини значень досліджуваних показників залишаються майже на тому ж рівні. Винятком є мітохондріальне дихання та активність СДГ, які збільшуються, відповідно, на 30,2% (р<0,05) та 9,2%. Восени підвищується споживання кисню спермою на 87,7% (р<0,001), в тому числі, мітохондріальне на 10,1% (р<0,001), азидрезистентне у 2,4 рази (р<0,001), активність ЦХО на 14,7% (р<0,001). Активність СДГ, порівняно з літнім періодом, не змінюється і становить 11,5±0,36 мкМ/хв/л. Взимку значення показників знижується, порівняно з осіннім періодом: споживання кисню спермою на 17,2% (р<0,01), азидрезистентне дихання на 28,1% (р<0,001), активність СДГ на 2,7%, ЦХО на 6,2% (р<0,05). Мітохондріальне дихання не змінюється і становить 11,0±0,76 нг-атом О/10⁸сперміїв. Вміст аскорбінової кислоти взимку і навесні майже однаковий (37,0 мкг/мл), влітку знижується на 21,4%, а восени знову підвищується до 53,7±4,59 мкг/мл (на 84,5%). Вміст дегідроаскорбінової і дикетогулонової кислот, низький взимку (11,2±1,04 мкг/мл), навесні і влітку збільшується на 13,4 і 26,8% (р<0,001), а восени досягає максимального значення – 20,9±1,11 мкг/мл. При цьому, відношення окремих складових у загальному вмісті аскорбінової кислоти свідчить про зниження частки аскорбінової кислоти від початку весни до літа на 5,0% і зростання окиснених продуктів на 12,5% (р<0,05). Влітку вміст дегідроаскорбінової і дикетогулонової кислот зменшується на 10,5%, а аскорбінової кислоти підвищується на 3,8%. Восени відношення аскорбінова кислота : окиснені продукти у загальному вмісті становить 71,9±2,43 : 28,1±2,44% і майже таке ж взимку (77,1±3,75:22,9±3,72%). Із фізіологічних показників еякуляту з сезоном року змінюється об’єм, з низького восени (3,4±0,21мл), взимку підвищується на 24,5% (р<0,001) і навесні досягає максимального значення (5,0±0,16мл). Влітку величина показника знижується на 20,0% (р<0,001), порівняно із весняним періодом, проте вища, ніж восени на 15,0% (р<0,05). Концентрація сперміїв максимальна в осінній період (1,05±0,03Ч10⁹/мл), зимою знижується на 8,6%, а весною і влітку – в межах 0,88–0,89Ч10⁹/мл. Кількість живих сперміїв в еякуляті низька весною (65,9±0,81%), влітку збільшується на 7,1% (р<0,001), а восени та взимку поступово знижується, відповідно, на 3,0 та 3,7%.

Вказані біохімічні показники змінюються з віком бугаїв. Зокрема, у спермі 2–3-річних плідників інтенсивність споживання кисню становить 26,5±4,70 нг-атом О/10⁸ сперміїв/хв, зі збільшенням віку до 5 років підвищується на 4,1% і у 6–9 річних залишається майже на тому ж рівні (27,0±3,35 нг-атом О/10⁸ сперміїв/хв). Частка кисню реалізована мітохондріями сперміїв у 2–3 річних бугаїв становить 10,8±2,75 нг-атом О/10⁸/хв, у 4–5-річних збільшується на 32,4%, старших 6-ти річного віку знову знижується на 27,7%. Азидрезистентне дихання у спермі плідників 4–5 років низьке (13,1±0,99 нг-атом О/10⁸/хв), у 2–3 та 6–9-річних вище, відповідно, на 19,8 та 27,4%.

Отже, у загальному об’ємі кисню утилізованого сперміями 2–3 річних бугаїв переважають немітохондріальні процеси (відношення до загальної кількості спожитого кисню мітохондріальної і немітохондріальної компонент – 40,7:59,2), у 4–5 річних зростає мітохондріальна компонента дихання (51,8:47,5), а у спермі плідників 6–9 річного віку – підвищується немітохондріальна (41,4:61,8).

Активність ферментів у спермі бугаїв від 2-х до 6 років майже не змінюється (СДГ 9,4–10,6 і ЦХО 30,5–32,3 мкМ/хв/л), у 6–9-річному віці зростає, відповідно, на 65,9 і 26,2% (р<0,001). Вміст аскорбінової кислоти характерний високим значенням (40,6±3,79 мкг/мл) в еякулятах бугаїв у віці 4–5 років, у 2–3 та 6–9-річних нижчий на 11,2–13,1%. Вміст дегідроаскорбінової і дикетогулонової кислот у спермі молодих бугаїв (2–3 роки) високий (12,5±1,53 мкг/мл), у 4–5 річних знижується на 14,6% (10,9±1,38 мкг/мл) і в 6–9 річних 7,3±1,06 мкг/мл що, нижче попереднього на 33,1% (р<0,05) і вихідного на 41,6% (р<0,01). Аналіз результатів свідчить про вірогідне (р<0,01) підвищення частки аскорбінової кислоти з 74,4% в еякулятах 2–3 річних плідників до 84,3% у 6–9 річних. Вміст продуктів окиснення вірогідно (р<0,01) знижується з 27,3% у 2–3 річному віці до 17,2% у 6–9-річних. Вікова динаміка фізіологічних показників еякулятів характерна низьким об’ємом (3,1±0,15 мл) у 2–3-річних бугаїв, але високим значенням концентрації та кількості живих сперміїв, відповідно, 0,97±0,05Ч10⁹/мл та 70,7±1,22%. Зі збільшенням віку до 5 років об’єм еякуляту підвищується на 45,1% (р<0,001), концентрація сперміїв на 10,3%, а кількість живих знижується на 3,5% (р<0,05). У 6–9 річних бугаїв об’єм еякуляту ще підвищується – на 15,5%, а концентрація і кількість живих сперміїв зменшуються, відповідно, на 14,7% і 1,6%.

Породні особливості окисно-відновних процесів у еякулятах бугаїв характерні високим споживанням кисню у спермі британо-фризьких та голштинських бугаїв (25,5±3,70 нг-атом О/10⁸сперміїв/хв), голландських і німецьких – нижчим, відповідно, на 10,8% і 16,9%. В еякулятах плідників української чорно-рябої молочної породи величина вказаного показника 20,2±3,27 нг-атом О/10⁸сперміїв/хв, що нижче ніж у британо-фризьких на 26,2%. Однак, у британо-фризьких та голштинських бугаїв понижене мітохондріальне дихання (10,3±2,75 і 8,7±0,21 нг-атом О/10⁸сперміїв/хв) і високе азидрезистентне (14,7±2,15 і 16,3±1,63 нг-атом О/10⁸ сперміїв /хв). Існує вірогідна різниця між значеннями мітохондріального дихання в еякулятах голштинських та голландських бугаїв (35,6%; р<0,001) і азидрезистентного – голштинських та українських чорно-рябих молочних (61,3%; р<0,05). В еякулятах плідників інших порід мітохондріальне та азидрезистентне споживання кисню майже не відрізняється і становить, відповідно, 10,6–11,8 та 10,1–12,9 нг-атом О/10⁸сперміїв/хв.

Активність окисних ферментів у зв’язку з породною належністю плідників також відрізняється і СДГ у спермі бугаїв німецької чорно-рябої породи становить 12,6±0,23 мкМ/хв/л, ЦХО – голштинських та британо-фризьких – 40,0±3,53 та 38,6±1,62 мкМ/хв/л. Вірогідна різниця активності СДГ (р<0,001) встановлена між еякулятами бугаїв німецької та голландської чорно-рябої порід, а ЦХО – голштинської, британо-фризької та української чорно-рябої молочної породи (р<0,01–0,001).

Найбільший об’єм еякуляту у бугаїв голштинської породи (4,5±0,47мл), нижчий на 4,5% в української чорно-рябої молочної, ще менший на 8,9–11,2% у голландських та німецьких чорно-рябих і найнижчий (3,8±0,21мл) у британо-фризьких. Максимальна концентрація сперміїв в еякулятах бугаїв німецької чорно-рябої породи (1,15±0,02Ч10⁹/мл), нижча на 4,4–5,3% голландської та британо-фризької, ще менша у голштинських та українських чорно-рябих, відповідно, на 11,4 і 14,0% (р<0,05 і 0,001). Кількість живих сперміїв у еякулятах плідників британо-фризької, голштинської та німецької порід однакова (68,0%), нижча на 1,0 – 2,0% у бугаїв української чорно-рябої та голландської селекції.

Інтенсивність окисно-відновних процесів в еякулятах бугаїв і якість сперміїв

Кореляції між показниками інтенсивності окисно-відновних процесів у еякулятах бугаїв та фізіологічними показниками сперміїв. Аналізом взаємозв’язків між біохімічними показниками встановлено, що дихальна активність сперми характеризує в більшій мірі (h = 0,72) споживання кисню мітохондріями та в меншій (h = 0,65) – інтенсивність азидрезистентного дихання, активність СДГ і ЦХО (h = 0,46 – 0,48). При цьому, споживання кисню мітохондріями позитивно корелює з дихальною активністю сперми (h = 0,60), інтенсивністю азидрезистентного дихання, активністю СДГ і ЦХО (h = 0,50 – 0,52), а азидрезистентне – проявляє сильний вплив на дихальну активність сперми (h = 0,74) і середній – на споживання кисню мітохондріями (h = 0,57), активність ЦХО (h = 0,52) і СДГ (h = 0,47). Між активністю СДГ і ЦХО існує сильний взаємозв’язок (h = 0,70 – 0,71), а між вказаними ферментами і споживанням кисню спермою, мітохондріальною та азидрезистентною компонентами дихання – середній (h = 0,48 – 0,50). Активність СДГ корелює з вмістом фракцій розчинних білків свіжоотриманої сперми, впливає на величину їх значень в процесі інкубування сперміїв. Кореляційне відношення за активністю СДГ для альбуміну свіжоотриманих еякулятів становить h = 0,33 і знижується, в інкубованій спермі, до h = 0,30. Величина статистичного показника також зменшується і для b- глобулінів, з h = 0,37 у свіжоотриманій спермі до h = 0,30 у інкубованій. Для a- і g- глобулінів, кореляційне відношення за активністю СДГ збільшується, відповідно, з 0,44 до 0,46 і з 0,41 до 0,53. Вміст альбуміну виявляє більший вплив на активність ферменту (h = 0,37) ніж навпаки (h = 0,33), для a- і g- глобулінів – рівнозначне кореляційне відношення (h = 0,41 – 0,44), а на b-глобуліни з більшою силою впливає активність ферменту (h = 0,37 проти h = 0,11).

Дихальна активність сперміїв позитивно корелює з виживанням їх у свіжоотриманих еякулятах (h = 0,15). Однак, аналіз зв’язку між споживанням кисню мітохондріями та виживанням сперміїв не виявив суттєвих відмінностей останнього, величина значення якого становить 85,8–90,1 хв (h = 0,10). Наведені результати свідчать про забезпеченість енергетичними субстратами і достатню кількість ресинтезованого АТФ для прямолінійного поступального руху сперміїв, навіть за низької активності мітохондріального дихання. Більший вплив на виживання сперміїв (h = 0,52) у свіжоотриманих еякулятах має азидрезистентна компонента дихання, що зумовлено здатністю статевих клітин забезпечувати фізіологічні процеси окисненням субстратів середовищ. Крім того, виявлено обернену залежність між активністю ЦХО і виживанням сперміїв у свіжоотриманих еякулятах (h = 0,41). У розмороженій спермі максимальне виживання (312,0±25,80 хв) проявляється при активності ЦХО 25,1–35,0 мкМ/хв/л (h = 0,24). Активність ЦХО позитивно корелює з резистентністю сперміїв у свіжоотриманій спермі (h = 0,33) та розмороженій (h = 0,30).

З виживанням і резистентністю сперміїв у свіжоотриманих еякулятах позитивно корелює вміст аскорбінової кислоти, відповідно, h = 0,34 і 0,41. Вплив її на наведені фізіологічні показники розмороженої сперми, відповідно, h = 0,19 і 0,39. Вміст дегідроаскорбінової і дикетогулонової кислот слабо впливає на виживання сперміїв свіжоотриманої сперми (h = 0,22) і проявляє обернений зв’язок з резистентністю сперміїв свіжоотриманих еякулятів (h = 0,29), їх виживанням (h = 0,33) та резистентністю у розмороженій спермі (h = 0,35).

Аналізом кореляцій фракцій розчинних білків виявлено прямий зв’язок між вмістом альбуміну, a-глобулінів і виживанням сперміїв свіжоотриманої сперми (h = 0,44 і 0,59) та обернений – з b- і g- глобулінами (h = 0,39 і 0,45).

Кореляції між фізіологічними показниками еякулятів та інтенсивністю окисно-відновних процесів у спермі бугаїв. Залежності окисно-відновних процесів від фізіологічних характеристик еякулятів свідчать, що вплив об’єму еякуляту на дихальну активність сперми, її компоненти – мітохондріальну та азидрезистентну, середній за силою (h = 0,41 – 0,49) з оптимальним значенням (2,0–6,0 мл). За вказаного об’єму еякуляту проявляється висока дихальна активність (17,0–20,1 нг-атом О/10⁸сперміїв/хв) і її компоненти: мітохондріальна 8,5–10,4, азидрезистентна 9,9–12,7 нг-атом О/10⁸ сперміїв/хв. Еякуляти об’ємом менше 2,0 мл та більше 6,0 мл характеризуються пониженою дихальною активністю. Виявлено позитивний зв’язок об’єму еякуляту з a-глобулінами (h = 0,40) і обернений з g-глобулінами (h = 0,45). При збільшенні об’єму еякуляту вірогідно зростає виживання сперміїв у свіжоотриманій спермі, а високе значення наведеного показника якості сперміїв (106,1–126,5 хв) проявляється при об’ємі більше 2,0 мл. У розмороженій спермі виживання сперміїв, незалежно від величини об’єму еякуляту, становить 276,0–282,0 хв.

Вплив концентрації сперміїв на споживання кисню середній за силою, але відрізняється за величиною і найвищий для азидрезистентного (h = 0,53), нижчий – дихальної активності сперми (h = 0,43) та мітохондріального дихання (h = 0,36). Збільшення кількості сперміїв у еякулятах супроводжується підвищенням немітохондріальних окисних процесів та гальмуванням АТФ-генеруючої здатності. Зокрема, аналіз активності ЦХО, величина якої позитивно корелює з концентрацією сперміїв (h = 0,60), засвідчив, що в еякулятах з максимальною кількістю статевих клітин (більше 1,40Ч10⁹/мл) у перерахуванні на 10⁹ сперміїв активність ферменту нижча у два рази, порівняно зі спермою середньої концентрації (0,81–1,00Ч10⁹/мл). Така залежність пояснює зниження виживання сперміїв свіжоотриманих еякулятів у зв’язку з активністю ЦХО.

Кореляційним аналізом фізіологічних показників сперміїв у зв’язку з їх концентрацією в еякуляті встановлено найбільшу тривалість виживання у свіжоотриманій спермі (110,3–119,0 хв) при концентрації до 1,40Ч10⁹/мл, розмороженій (312,0±7,32 хв) – при 0,60–1,00Ч10⁹/мл. Висока резистентність сперміїв у свіжоотриманих еякулятах (25,6–27,7 тис) проявляється за концентрації 0,60–1,40Ч10⁹/мл.

Кількість живих сперміїв позитивно корелює з величиною азидрезистентного споживання кисню (h = 0,41; здатністю окиснювати субстрати) та обернено – з мітохондріальною компонентою (h = 0,24; підвищеною енергогенеруючою здатністю) і дихальною активністю сперми (h = 0,33). Оскільки кількість живих сперміїв позитивно корелює з відносним вмістом азидрезистентного споживання кисню (r = +0,83, коливання – r = +0,74–0,92), даний біохімічний показник слід використовувати для об’єктивного оцінювання якості свіжоотриманих еякулятів. Кількість живих сперміїв виявляє обернену кореляцію з вмістом альбуміну (h = 0,38) та позитивну з a-глобулінами (h = 0,33), а b- та g- глобуліни не змінюються і знаходяться в межах, відповідно, 15,6–16,1% і 29,9–32,8% (h = 0,13). Кількість живих сперміїв вірогідно впливає на виживання їх у свіжоотриманих еякулятах та резистентність, після розморожування сперми і при 60,0–80,0% названі показники становлять, відповідно, 116,1±3,04 хв і 12,0–13,0 тис.

З аналізу кореляцій між вказаними фізіологічними характеристиками еякуляту і вмістом аскорбінової кислоти та продуктів її окиснення (h = 0,05–0,19) випливає, що коливання наведених біохімічних показників залежить від інтенсивності окисних процесів у спермі, синтезу в організмі і нагромадження аскорбінової кислоти в спермі бугаїв.

Антиоксиданти у складі розріджувача сперми бугаїв, якість та запліднююча здатність сперміїв

Дослідженнями встановлено, що аскорбінова кислота і глутатіон позитивно впливають на життєздатність сперміїв. Так, додавання АА і Г-SH до розріджених еякулятів бугаїв збільшує кількість живих сперміїв протягом 30 хв інкубування і підвищує тривалість виживання. Висока збереженість сперміїв (33,2–47,8%) проявляється при внесенні 2,50 мМ АА або Г-SH і їх поєднанні – 1,25+1,25; 1,25+2,50; 2,50+2,50 мМ (рис. 2). У свіжоотриманій спермі високе виживання

Активність ферментів дихання і інтенсивність споживання кисню сперміями бугаїв за дії антиоксидантів. Дослідженням інтенсивності дихання статевих клітин і активності окисних ферментів виявлено, що зі збільшенням доз Г-SH (1,25; 2,50; 5,00 мМ), підвищується споживання кисню до 30,4–47,9 нг-атом О/10⁸сперміїв/хв (р<0,001; табл. 2). При цьому, стимулюється активність СДГ, яка при 1,25 мМ зростає на 75,6%, 2,50 мМ – на 129,7% і при 5,00 мМ – на 168,9%, а ЦХО – знижується при вказаних дозах, відповідно, на 4,9, 21,9 і 48,7%.

Таблиця 2

Інтенсивність окисно-відновних процесів у розбавленій спермі з антиоксидантами

Частини еякуляту	Вміст доданих речовин, мМ	Поглинання кисню, нг-атом О/ 108сперміїв/хв		Активність ферментів, мкМ/хв/л
				СДГ		ЦХО
		n	M ± m	n	M ± m	n	M ± m
Контрольна	-	14	20,6±2,86	10	7,4±0,89	10	29,6±1,95
Дослідні: аскорбінова кислота (АА)	1,25	14	27,6±2,66	10	8,3±0,63	10	39,5±2,73*
	2,50	14	24,2±3,35	10	7,7±0,92	10	39,2±2,96*
	5,00	14	21,9±0,94	10	6,2±0,87	10	35,9±3,18
відновлена форма глута- тіону (Г-SH)	1,25	14	30,4±2,64*	10	13,0±0,56***	10	28,2±2,20
	2,50	14	47,9±5,91***	10	17,0±0,40***	10	21,6±2,63*
	5,00	14	45,5±3,40***	10	19,9±1,11***	10	15,2±1,83***
АА + Г-SH	1,25 + 2,50	14	28,7±3,15	10	16,2±0,79***	10	2,5±0,56***

Дія аскорбінової кислоти також залежить від внесеної дози. Мінімальний вміст її (1,25мМ) стимулює дихання на 40,0%, підвищує активність СДГ і ЦХО, відповідно, на 12,1 і 33,4%. Підвищення вмісту (більше 2,50 мМ) знижує інтенсивність дихання, порівняно з максимальним значенням, на 14,0–26,0%, активність СДГ на 7,8–33,8% і ЦХО на 0,7–10,0%. Поєднання обох компонентів (АА+Г-SH – 1,25+2,50 мМ) підвищує поглинання кисню на 39,3%, активність СДГ на 118,9% і знижує ЦХО майже в 12 разів.

Аналогічні зміни СДГ і ЦХО за дії антиоксидантів виявлені при вивченні активності ферментів у розмороженій спермі.

Позитивний вплив антиоксидантів у розріджувачі еякулятів зумовлений здатністю Г-SH шунтувати потік електронів як з НАД-залежної, так і кінцевої ланок дихального ланцюга (ЦХО) і забезпечувати альтернативні шляхи їх утилізації (рис. 4). АА, після інгібування дихальної активності сперміїв аміталом, повністю відновлює споживання кисню (до інгібування – 58,7±12,74 нг-атом О/10⁸ сперміїв/хв, при максимальній дозі – (5,00 мМ) – 60,7±9,93 нг-атом О/10⁸ сперміїв/хв).

Додавання вказаного антиоксиданта в наростаючих дозах, на фоні дії азида, знижує інтенсивність поглинання кисню в 1,5–3,7 рази.

Інтенсивність споживання кисню сперміями за умов ”окисного навантаження” та наявності антиоксидантів у спермі бугаїв. Вивченням шляхів реалізації впливу антиоксидантів на окисно-відновні процеси в сперміях виявлено, що окиснення SH-груп глутатіону т-БГП, гальмує дихальну і відновну активності статевих клітин, відповідно, на 42,5 і 53,1%.

Це дає підстави стверджувати, що SH-групи глутатіону відіграють важливу роль в енергозабезпеченні сперміїв, їх здатності виживати у зовнішньому середовищі, а ”окисне навантаження”, що виникає в процесі технологічної підготовки еякулятів до заморожування та при розморожуванні знижує інтенсивність обмінних процесів та запліднюючу здатність сперміїв. На фоні дії т-БГП та інгібіторів гліколізу, НАД-залежної і термінальної ланки знижуються, відповідно: споживання кисню – на 15,8%, 16,6% і 28,8%, відновна активність – втричі та на 32,1% і 3,0%. При поєднанні Г-SH+т-БГП і блокуванні гліколізу та НАД-залежної ділянки дихального ланцюга споживання кисню і відновна активність сперміїв вищі, відповідно, на 53,2%, 55,4% і 46,4% та у 10 разів, порівняно з величинами значень при дії т-БГП. З пригніченням термінальної ділянки (ЦХО) дихальна активність залишається вищою на 52,7%, а відновна – не змінюється (0,3±0,03 мкг К₃…/0,1 мл/хв). Аналогічно, споживання кисню сперміями за поєднання АА+т-БГП, після інгібування гліколізу, НАД-залежної і кінцевої ланок дихального ланцюга, вища на 85,1% та у 15 і 34 рази порівняно Г-SH+т-БГП і на 93,3% та у 30 і 60 разів – з т-БГП. Відновна активність також вища, відповідно, на 76,2, 87,1 і 99,0% ніж при поєднанні Г-SH + т-БГП і 87,3–99,0% – за наявності т-БГП.

Подібна закономірність виявлена при аналізі стану електрон-транспортних ланок дихального ланцюга під впливом інгібіторів і присутності субстратів, антиоксидантів та т-БГП. Спермії бугаїв проявляють різну дихальну та відновну активності і визначають цю різницю субстрати й можливі шляхи їх перетворення, здатність акцепторів приймати та передавати електрони вздовж ланцюга дихання або постачати на зовнішньоклітинні акцептори (рис. 7). У повнокомпонентному середовищі (ЛЖГ) з антиоксидантами та т-БГП, змінюються можливості використання альтернативними метаболічними шляхами різних за біохімічними характеристиками сполук, оскільки спермії для забезпечення енергетичних потреб окиснюють більш енергоємкі субстрати (жовток), що призводить до зростання азидрезистентного (немітохондріального) окиснення.

Ефективність використання антиоксидантів у складі розріджувача для заморожування сперми бугаїв. Різні дози АА і Г-SH в розріджувачі виявляють вплив на виживання сперміїв і активність ферментів розмороженої сперми (табл. 3). Однак, якщо максимальний вміст Г-SH (5,00 мМ) в ЛЖГ-середовищі знижує виживання сперміїв на 40 хв (р > 0,05), то підвищення дози АА з 1,25 до 2,50 та 5,00 мМ зумовлює зниження величини названого показника, відповідно, на 25,0, 115,0 та 235,0 хв (р<0,001). При цьому, збільшення дози Г-SH стимулює активність СДГ, відповідно, в 3,1, 12,8 та 24,3 рази. Активність ЦХО знижується, відповідно, на 36,0%, 52,9% та 85,4%. Аскорбінова кислота в дозі 1,25 мМ понижує активність СДГ на 13,7%, а при 2,50 та 5,00 мМ підвищує на 22,7% та 100%, відповідно. На активність ЦХО додавання АА в дозах 1,25 та 2,50 мМ виявляє однаковий вплив (13,4–13,8 мкМ/хв/л), а 5,00 мМ – активність підвищує на 90,4%. Поєднання в розріджувачі АА+Г-SH (відношення 1,25:2,50 мМ) знижує активність СДГ на 21,3%, ЦХО на 27,6%, резистентність та виживання сперміїв, відповідно, на 44,0% та 5,5%, підвищує вміст МДА на 22,7%. При цьому, активність сперміїв як у контрольних, так і дослідних пробах не змінюється і становить 3,6 бала.

Таблиця 3

Виживання сперміїв і активність ферментів у розмороженій спермі з антиоксидантами, n = 19; M ± m

Доза антиокси- данта, мМ	Виживання сперміїв, хв	Активність ферментів у спермі, мкМ/хв/л
		СДГ	ЦХО
Аскорбінова кислота
Контроль	495,0 ± 7,07	2,2 ± 0,78	10,5 ± 0,68
Дослід: 1,25	470,0 ± 21,61	1,9 ± 1,22	13,4 ± 0,70**
2,50	380,0 ± 43,25	2,7 ± 1,06	13,8 ± 1,36
5,00	260,0 ± 16,30***	4,4 ± 1,65	20,0 ± 2,04***
Відновлена форма глутатіону
Контроль	495,0 ± 7,07	0,7 ± 0,35	14,2 ± 1,80
Дослід: 1,25	500,0 ± 8,16	2,2 ± 0,78	9,1 ± 0,68*
2,50	500,0 ± 8,39	9,0 ± 1,15***	6,7 ± 0,74**
5,00	460,0 ± 40,81	17,0 ± 2,65***	3,5 ± 1,22***

Зміна співвідношення АА+Г-SH в сторону зменшення дози першої (0,35 : 2,50 мМ) забезпечує підвищення виживання сперміїв на 30,1% (р<0,001) і активності СДГ на 11,5%, але знижується ЦХО на 36,2%. Значення інших досліджених показників не відрізняються і знаходяться в межах: рухливість сперміїв – 3,8 бали, резистентність 6,4–8,0 тис, вміст МДА 10,2–10,8 нг/мл. Наступне зменшення вмісту АА (відношення АА : Г-SH – 0,25 : 2,50 мМ) не впливає на фізіологічні і біохімічні показники статевих клітин.

При осіменінні корів і телиць спермою з використанням антиоксидантів у пропорції АА+Г-SH – 0,35:2,50 мМ – заплідненість після першого осіменіння становила в різних господарствах 25,0–76,6%, в контрольній групі тварин 12,5–67,2%, різниця – 9,4–13,3% (рис. 8). Рис. 8. Заплідненість, після першого осіменіння, корів і телиць спермою з використанням антиоксидантів. Господарства: І – Грабово; ІІ – ім. Шевченка; ІІІ – Побужанське

Інтенсивність окисних процесів при дозріванні та капацитації сперміїв бугаїв

Результати досліджень свідчать, що під впливом гомогенату слизової матки, фолікулярної рідини, гепарину, альбуміну сироватки крові бугая, амідопірину, перекису водню доданих до середовищ капацитації, у сперміїв з придатка сім’яника відбуваються морфологічні зміни в ділянці акросоми та хвоста і підвищується їх активність (табл. 4). Гіперактивний рух сперміїв супроводжується підвищенням дихання на 100–200%, відновної здатності – 20,0–50,0%, активності Г-6-ФДГ – 9,0–15,3%, СДГ – 16,9–100%, зміною спектру білків.

 

Таблиця 4

Інтенсивність акросомної реакції сперміїв бугаїв у зв’язку з середовищами і тривалістю капацитації, n = 15; M ± m

Середовища капацитації	Кількість сперміїв (%) з акросомною реакцією протягом:
	30 хв	60 хв	120 хв
Фосфатно-сольовий буфер (ФСБ)	19,2±2,03	33,0±2,66***	38,6±3,26***
Гомогенат слизової матки (СМ) корови	43,0±5,59	50,6±3,23	59,6±5,46*
Фолікулярна рідина (ФР)	36,2±4,34	58,5±3,56***	59,4±3,08***
Гепарин (ГП)	36,6±3,57	44,6±1,47	61,6±4,02***
Альбумін сироватки крові бугая (БСА)	32,8±4,59	43,8±6,22	57,0±3,51***
Амідопірин (АМП)	34,8±2,99	40,8±4,73	52,6±6,14*
Перекис водню (Н2О2)	34,4±4,76	44,2±5,70	55,6±3,58***

У загальній кількості використаного кисню зростає частка аеробного гліколізу на 24,0–39,0% та інтенсивність транспорту електронів на 29,0–43,0%. Підвищується активність Г-6-ФДГ у сперміях при використанні ГП та ФР, відповідно, на 15,3 і 9,0%. Активність СДГ залежить від факторів капацитації і з ГП підвищується на 16,9%, а з ФР знижується на 30,0–63,3%.

Інтенсивність транспорту електронів через НАД-залежну ділянку ланцюга дихання також залежить від факторів капацитації: найвища при додаванні ФР (57,9%), висока при ГП, АМП та ФСБ (47,3–52,9%), нижча при БСА та H₂О₂ (41,2–42,5%) і найнижча у середовищі з СМ (27,1%). Відновна активність знижується на 34,0% у БСА та на 50,0% АМП і підвищується на 40,0% з ГП. У середовищах капацитації використання інгібітора кінцевої ланки дихального ланцюга виявило інтенсивніше споживання кисню сперміями на 10,0–65,0%, що свідчить про підвищення немітохондріальних окисних процесів. Вища відновна активність сперміїв проявляється у середовищах з ГП та АМП, відповідно, на 25,0 та 50,0% і нижча на 25,0% – із БСА. Виявлена різниця дихальної і відновної активності у зв’язку з середовищами капацитації вказує на існування різних механізмів стимулювання цього процесу у сперміях.

Поряд з активацією окисних процесів, відбуваються зміни у спектрі розчинних та структурних білків сперміїв. Після зберігання СС при 0 – +4°С, порівняно зі свіжоотриманою, вміст альбуміну знижується на 23,7% у суспензії сперміїв, 16,5% – сперміях, 27,0% – середовищі інкубування, а б-глобулінів – зростає, відповідно, на 15,1, 9,7 та 15,5%. Вміст в-глобулінів зменшується в сперміях на 18,7% і зростає в супернатанті на 22,4%. У статевих клітинах підвищується вміст білків з ММ 14,4, 30,0, 67,0 і більше 94,0 кДa, а в супернатанті – знижується, з ММ 20,1 і 94,0 кДa – зменшується в сперміях і збільшується у супернатанті. Крім цього, у збережених пробах (сперміях і супернатанті) знижується вміст білків у зонах ММ від 30,0 до 45,0 та від 67,0 до 94,0 кДa і підвищується – від 45,0 до 67,0 кДa.

Фізіологічна та біохімічна характеристика антральної рідини фолікулів, ооцит-продуктивність яєчників корів

Дослідженням фолікулів яєчників корів виявили значну мінливість біохімічних показників. Величини дихальної активності й відновної здатності ооцитів та ооцит-кумулюсних комплексів відрізнялись на 27,0–80,9%; клітин гранульозного шару фолікулів – 8,0–47,9%, Г-6-ФДГ – 24,9–44,7%; у фолікулярній рідині вміст антиоксидантів – 23,1–38,1%, білка, фракцій білків та в їх складі глікопротеїнів – 1,4–32,7%. Наведені коливання величин показників зумовлені фізіологічним станом яєчників, розміром фолікулів, числом клітин гранульозного шару та ооцит-продуктивністю. Так, в яєчниках однакового фізіологічного стану при розмірі фолікула до 4 мм кількість клітин гранульози становить 22–25Ч10⁶ /мл, менше у середніх на 33,0–50,0%, великих – у 2–3 рази. Вказана закономірність спостерігається у фолікулах всіх досліджених яєчників, однак сила впливу одного і того ж фізіологічного стану на кількість клітин гранульози неоднакова: при фолікулярному зростанні – h = 0,13, свіжій овуляції – h = 0,37, ранньому та пізньому жовтому тілі, відповідно, h = 0,34 та 0,41. За послідовної зміни фізіологічного стану яєчників: “фолікулярне зростання”®“свіжа овуляція”®“раннє”®“пізнє” жовте тіло та малому розмірі фолікула кількість клітин гранульози низька за “свіжої овуляції” (22,3±3,26Ч10⁶/мл) і вища на 10,3–13,9% у фолікулах яєчників інших фізіологічних станів; при середньому розмірі – різниця, відповідно, 8,5, 15,1, 5,6%; великому – зменшується на 32,9 та 42,7% і підвищується на 5,8% при зміні фізіологічного стану “раннє”®“пізнє” жовте тіло.

Вищою ооцитпродуктивністю характеризуються яєчники корів “раннього” жовтого тіла – 3,4 та “пізнього” – 3,0 ОКК – з одного яєчника, у стані “фолікулярного зростання” та “свіжої овуляції” – 2,4 ОКК. При цьому, незалежно від фізіологічного стану яєчника, найбільше ооцитів відібрано з фолікулів малого розміру (“фолікулярного зростання” – 1,7±0,14; “свіжої овуляції” – 1,3±0,29; “раннього” та “пізнього” жовтого тіла, відповідно, 2,3±0,46 і 2,2±0,32), а з середнього та великого менше на 40,5–77,3% і 77,0–86,4%, відповідно.

Інтенсивність дихання клітин гранульози становить 8,1–25,1 нг-атом О/0,1мл СК/хв, а відновна активність 0,4–2,3 мкг К₃.../мл СК/хв. Використання кисню окремими метаболічними шляхами клітин гранульози залежить від фізіологічного стану та розміру фолікулів. Так, аеробним гліколізом кисню реалізується від 9,9% (середнього фолікула яєчника “фолікулярного зростання”) до 42,3% (малого фолікула яєчника “свіжої овуляції”); НАД-залежною ланкою дихального ланцюга – від 13,3% (малих фолікулів яєчника “раннього” жовтого тіла) до 49,2% (середнього фолікула яєчника “фолікулярного зростання”); ціанідрезистентним шляхом – від 26,9% (середній фолікул “раннього” жовтого тіла) до 55,5% (великий фолікул “раннього” жовтого тіла).

Підвищена дихальна та відновна активність клітин гранульозного шару фолікулів зумовлює їх синтетичну функцію. Зокрема, у малих фолікулах активність

Г-6-ФДГ підвищується при зміні фізіологічного стану яєчника “фолікулярного зростання”®“свіжа овуляція” на 33,0% досягаючи максимуму за “раннього” жовтого тіла (18,6±4,61 мкМ НАДФН/мл/хв) і знижується – у період “пізнього” жовтого тіла ®“фолікулярного зростання”, відповідно, на 17,8 і 29,5%. При середньому розмірі фолікула яєчника “фолікулярного зростання” активність ферменту низька (5,2±1,10 мкМ НАДФН/мл/хв), зростає при “свіжій овуляції” на 57,6% і залишається майже на такому ж рівні за “раннього” і “пізнього” жовтого тіла (7,4–9,3 мкМ НАДФН/мл/хв). У великих фолікулах активність Г-6-ФДГ зростає при зміні фізіологічного стану яєчника: “фолікулярне зростання” ® “свіжа овуляція” ® “раннє” ® “пізнє” жовте тіло, відповідно, на 47,7, 18,4 і 54,5% і знову знижується при “фолікулярному зростанні” на 73,1% (до 4,4±1,58 мкМ НАДФН /мл/хв).

Білки фолікулярної рідини антральних фолікулів яєчників корів. Про інтенсивність синтетичних процесів у період розвитку фолікулів і змін фізіологічного стану яєчника свідчить вміст загального білка та його фракцій у фолікулярній рідині. Вказана зміна зумовлює в більшій мірі відмінності альбумінів (h = 0,29–0,54) та у складі фракції, глікопротеїнів (h = 0,51–0,72) фолікулярної рідини однакових за розміром фолікулів різних за фізіологічним станом яєчників, порівняно з їх вмістом (h = 0,13–0,42 і 0,11–0,44) у різних фолікулах одного фізіологічного стану статевої залози.

Вміст a-глобулінів та їх глікопротеїнового компоненту залежить як від фізіологічного стану яєчників, так і розміру фолікула. Проте, від останнього більше залежать глікопротеїни a-глобулінової фракції h = 0,18–0,53, ніж загальний вміст вказаних білків h = 0,10–0,30. Така ж залежність a-глобулінів проявляється в зв’язку з фізіологічним станом яєчника (”фолікулярне зростання”®”свіжа овуляція”®”раннє”®”пізнє” жовте тіло): вища сила впливу на глікопротеїновий компонент (розмір фолікула більше 7мм – h = 0,63, 4–7мм – h =0,43 і менше 4мм – h = 0,53) і слабка – на загальний вміст фракції (h = 0,20–0,30).

У антральній рідині різних за розміром фолікулів однакового фізіологічного стану яєчника кореляційне відношення за b-глобулінами для ”фолікулярного зростання”, ”раннього” та ”пізнього” жовтого тіла становить, відповідно, h = 0,11, 0,24 та 0,34 і зі ”свіжою” овуляцією h = 0,54. При цьому, у вказаній фракції проявляється слабка залежність вмісту глікопротеїнів (h = 0,21–0,27). При послідовній зміні фізіологічного стану яєчника: ”фолікулярне зростання”®”свіжа овуляція”®”раннє”®”пізнє” жовте тіло та розмірі фолікулів більше 4 мм кореляційне відношення за вмістом b-глобулінів і глікопротеїнів, відповідно, h = 0,53 і 0,34, менше 4мм – h = 0,33 і 0,42.

Аналіз сили зв’язків між g-глобуліновою фракцією білка, її глікопротеїновою частиною, у антральній рідині та діаметром фолікулів статевої залози однакового фізіологічного стану свідчить про сильну залежність між ними за свіжої овуляції (h = 0,56 і 0,37). Для вмісту вказаної фракції у фолікулярній рідині при послідовній зміні фізіологічного стану яєчника: ”фолікулярне зростання”®”свіжа овуляція”®”раннє”®”пізнє” жовте тіло та діаметрі фолікула більше 7мм кореляційне відношення становить для загального вмісту h = 0,57, глікопротеїнового компонента – h = 0,60, 4–7мм, відповідно, h = 0,36 і 0,65 та менше 4мм – h = 0,13 і 0,66. Отже, в яєчнику ”свіжої овуляції” проявляються високий вміст загального білка (7,1–7,8 г%) і глікопротеїнів у зоні g-глобулінів (56,6–68,9 %) та низький – у зоні альбуміну (5,4–11,6%), порівняно з яєчниками інших фізіологічних станів (6,4–7,3 г% та 27,3–35,8 %).

Вміст антиоксидантів в антральній рідині фолікулів та зв’язок з фізіологічним станом яєчників корів. Інтенсивність окисних процесів регулюється рівнем природних антиоксидантів, що підтверджується їх вмістом та співвідношенням відновлених і окиснених форм у фолікулах. Так, в антральній рідині фолікулів яєчників корів вміст відновленої форми глутатіону становить 17,3–33,7 мг%, аскорбінової кислоти – 10,0–21,2 мкг/мл, окиснених форм, відповідно, 10,0–19,1 мг% і 8,3–14,7 мкг/мл, загального глутатіону – 27,0–51,4 мг%, аскорбінової кислоти з окисненими продуктами – 21,9–34,0 мкг/мл. Найвищий вміст відновлених форм антиоксидантів (Г-SH 24,5–33,7 мг%, АА 12,9–21,1 мкг/мл) у період “пізнього” жовтого тіла. Аналіз відношення між відновленими і окисненими формами антиоксидантів виявив найвищий відсоток АА у великому і середньому фолікулах яєчника “фолікулярного зростання” (68,2–71,4 : 35,4–38,6%), та зниження у фолікулах малого розміру всіх інших фізіологічних станів яєчників (59,9–64,0 : 36,1–50,6%) і найменший у великому фолікулі яєчника “свіжої овуляції” (55,4 : 49,2%). Подібні синхронні зміни з АА, відсотку Г-SH та Г-SS-Г у великому і середньому фолікулах “свіжої овуляції” (53,9–59,1 : 40,9–46,1%) свідчать про тісний зв’язок між вказаними антиоксидантами. Найвищий вміст Г-SH (69,4±5,32%) виявлено у великому фолікулі яєчника “пізнього жовтого тіла”.

Дихальна та відновна активності ооцит-кумулюсних комплексів (ОКК) корів in vitro. Закономірності розвитку фолікулів, клітин гранульозного шару, підтверджуються інтенсивністю дихання ооцитів. Виявлена обернена залежність між поглинанням кисню ОКК у середовищі Дюльбеко, 199, Іґла і RPMI–1640 та розміром фолікула, пряма – з наявністю і компактністю кумулюсу (великі за діаметром, без кумулюсу – 0,09–0,19, середні, з розпушеним кумулюсом – 0,11–0,30, малі, з компактним кумулюсом – 0,17–0,47 нг-атом О/ооцит/хв). Отже, ооцити з компактним кумулюсом інтенсивно поглинають кисень, що з втратою компактності – знижується. При дослідженні у ФСБ Дюльбеко після інкубування 24 год, ОКК проявляють вищу дихальну активність: з компактним кумулюсом малого фолікула на 17,6%, з розпушеним кумулюсом середнього фолікула – 36,3% і без кумулюсу великого фолікула – 44,4%. Інкубування ооцитів 24 год у середовищах ТС 199 та Іґла призводить до зменшення дихальної активності, порівняно з свіжоотриманими: у ОКК з компактним кумулюсом малого фолікула, у першому – нижча на 10,3%, другому – на 7,7%; з розпушеним кумулюсом з середнього та без кумулюсу з великого фолікулів у обох середовищах майже не змінюється (ТС 199 – 0,20–0,22 і 0,13–0,14; Іґла – 0,24–0,26 і 0,19–0,22 нг-атом О/ооцит/хв). У RPMI-1640 використання кисню ооцитами з компактним кумулюсом малого фолікула також не змінюється (0,45±0,090 нг-атом О/ооцит/хв), але знижується на 30,0% – з розпушеним кумулюсом середнього фолікула та зростає на 15,7% – без кумулюсу великого фолікула.

Вивчення окремих ланок утилізації кисню показало, що у свіжоотриманих ооцитів при інгібуванні гліколізу дихальна активність зростає: у ОКК з розпушеним кумулюсом у 2,4 рази та без кумулюсу в 2,9 рази і знижується з компактним кумулюсом на 23,6%.

ОКК проявляють реакцію-відповідь на доданий АТФ – споживання кисню зростає з розпушеним кумулюсом на 13,4%, з компактним – на 39,9%, ”голі” не реагують. Через 24 год інкубації знижується реакція – відповідь на доданий АТФ у ОКК з розпушеним і компактним кумулюсом на 37,5–40,0%, що свідчить про здатність забезпечувати енергетичні потреби окисненням запасів власних субстратів та підтримувати даний процес за рахунок клітин – симбіонтів (кумулюсу), а при нестачі поживних речовин у середовищах культивування – можливе зворотне постачання їх з ооцита до клітин кумулюсу. НАД-залежна ділянка ланцюга дихання у ”голих” ооцитів не активна, а в ОКК з компактним кумулюсом, використання кисню зростає на 57,2%, з розпушеним – знижується на 79,1%. Сукцинат стимулює споживання кисню ОКК з компактним кумулюсом на 38,4%, з розпушеним на 70,0% та без кумулюсу на 13,0%. Ооцити проявляють значну інтенсивність немітохондріальних окисних процесів (нг-атом О/ооцит/хв): з компактним кумулюсом 0,10±0,006, без кумулюсу – 0,13±0,006 і з розпушеним – 0,27±0,006.

Вивченням окисно-відновних процесів ооцитів у середовищі RPMI-1640 виявлена пряма залежність між компактністю кумулюсу та інтенсивністю дихання ооцитів (ОКК з компактним кумулюсом 0,47±0,08 нг-атом О/ооцит/хв, нижча на 36,2% з розпушеним і найнижча – 0,19±0,05 нг-атом О/ооцит/хв – без кумулюсу) і обернена – з відновною активністю (без акцептора електронів: ОКК з компактним кумулюсом – 16,0±5,55 пкг К₃.../ооцит/хв, а ооцити з розпушеним та без кумулюсу виявляють однакову відновну активність – 18,3 пкг К₃.../ооцит/хв). Встановлена залежність підтверджує симбіотичні взаємодії ооцитів з кумулюсом (гранульозою). Акцептор електронів у середовищі культивування знижує дихальну активність ооцитів з компактним кумулюсом та ”голих”, відповідно, на 29,8% та 68,5%, а з розпушеним – не змінює (0,31±0,11 нг-атом О/ооцит/хв). При цьому, відновна здатність зростає у всіх групах ооцитів: з компактним і розпушеним кумулюсом у 6,4, без кумулюсу – в 11,1 рази. Гальмування активності гліколізу підвищує дихання ооцитів: на 52,4% з компактним кумулюсом та 22,5% розпушеним і зменшує відновну активність, відповідно, на 58,0% і 40,0%. У ооцитів без кумулюсу дихання не змінюється (0,06±0,00 нг-атом О/ооцит /хв), а відновна здатність підвищується на 32,3%. Використання аміталу знижує дихальну активність у ооцитів з компактним кумулюсом на 89,5% і відновну – на 16,7%, з розпушеним кумулюсом, відповідно, на 67,5% і 42,9%. У ооцитів без кумулюсу дихання не змінюється (0,06 нг-атом О/ооцит/хв), а відновна здатність – знижується на 83,4% (до 50,0±34,00 пкг К₃.../ооцит/хв). Отже, при забезпеченні субстратами, ооцити без кумулюсу отримують енергію, головним чином, через гліколіз; з компактним кумулюсом – споживання кисню (генерація АТФ) визначається активністю циклу трикарбонових кислот; з розпушеним кумулюсом займають проміжне місце – підвищений гліколіз та збережене дихання.

При інгібуванні активності ЦХО встановлено у ОКК з компактним кумулюсом істотне підвищення (у 2,4 рази) відновної здатності та зниження використання кисню (до 0,06 нг-атом О/ооцит/хв), з розпушеним – зменшення відновної активності на 85,8% та збільшення споживання кисню на 23,0%. У ооцитів без кумулюсу азид натрію підвищує дихання на 85,0%, а відновну здатність – знижує на 44,6%. При стимулюванні НАДН-редуктазних процесів у ОКК з компактним кумулюсом підвищується споживання кисню (азидрезистентного) та відновна активність, відповідно, на 62,5 та 7,3%; з розпушеним кумулюсом – дихання майже відсутнє (0,09±0,05 нг-атом О/ооцит/хв), а транспорт електронів зростає більше ніж у 12 разів; без кумулюсу – споживання кисню знижується на 75,0%, а відновні процеси – підвищуються на 60,5%. Як наслідок, за рахунок вільнорадикального окиснення жирних кислот, ОКК з компактним кумулюсом споживають 50,0% кисню (азидрезистентного) та транспортують 23,1% відновних еквівалентів; з розпушеним кумулюсом та без кумулюсу – дихальна активність не змінюється, а відновна, відповідно, у перших зростає на 57,2% (до 163,3±24,60 пкг К₃.../ооцит /хв), у других – знижується на 23,9%.

Культивування ембріонів. Використання середовищ культивування (ТС 199, Іґла, RPMI-1640) з додаванням фетальної та еструсної сироваток, антиоксидантів, клітин гранульози, гомогенату слизової з верхньої третини рогу матки корів, інсуліну та гепарину забезпечує повноцінний розвиток ембріонів. Ооцити, з компактним кумулюсом запліднюються та розвиваються до бластоцисти, а з іншими морфологічними характеристиками, розвиток до пізніх стадій припиняється. Додавання антиоксидантів 0,01мл на 1мл середовища культивування (суміші відновленої форми глутатіону і аскорбінової кислоти, відповідно, 15,3 і 4,4мг в 1,0мл), проявляє позитивну дію на розвиток ембріонів. Із 79 клітин, через 144 год з моменту запліднення, виявлено 5 ембріонів (6,3%): 4 ранніх і 1 пізня морула. Аналогічні дослідження проведені з використанням середовищ Іґла та RPMI-1640. Отримано ембріонів, відповідно, 5 (7,5%) – 3 ранні і 2 пізні морули із 67 та 6 (8,3%) – 4 ранні і 2 пізні морули із 72 запліднених ооцитів.

Результати досліджень свідчать, що для запліднення ооцитів та вирощування ембріонів найефективніше проводити культивування у два етапи: 1) культивування (16–18 год) і запліднення (16–18 год) ооцитів у середовищах ТС 199, Іґла, RPMI-1640, які містять: 10% фолікулярної рідини, 10% еструсної сироватки крові корів, 10% фетальної сироватки крові, клітини гранульозного шару фолікулів, 0,03% інсуліну (0,13 од/мл), 0,001% гепарину (5 од/мл). Заміну середовища проводити перед заплідненням та після 16–18-годинного спільного культивування ооцитів і сперміїв; 2) культивування ембріонів у середовищах ТС 199, Іґла, RPMI-1640, які містять, крім вище перерахованих компонентів, 10% гомогенату слизової з верхньої третини рогу матки корів. Заміну середовища проводити через кожні 48 год протягом культивування.

Розділення періоду культивування на два окремі етапи і, відповідно, використання гомогенату слизової з верхньої третини рогу матки в складі середовищ вирощування сприяє розвитку ембріонів до стадії бластоцисти. Найкраще розвиваються ембріони в середовищі RPMI-1640. За 10 діб культивування отримано 18,4% бластоцист і в тому числі 7,2% без прозорої оболонки. Менше бластоцист при культивуванні в середовищах Іґла та ТС 199, відповідно, 28 (14,9%) і 17 (11,0%). З них без прозорої оболонки, відповідно, 11 (5,8%) та 2 (1,3%).

Окисно-відновні процеси в бластоцистах корів. В процесі розвитку ембріони використовують кисень та проявляють відновну здатність. Існує пряма залежність стадій розвитку бластоцист з дихальною активністю (ранні бластоцисти 0,09±0,01 нг-атом О/ембріон/хв, на 10,0% вище у пізніх, максимальна у бластоцист без прозорої оболонки – 0,11±0,02 нг-атом О/ембріон /хв) і обернена – з відновною (ранні – 37,0±9,00 пкг К₃…/ембріон/хв, у пізніх нижча на 21,7% і у бластоцист без прозорої оболонки найнижча – 13,0±2,01 пкг К₃…/ембріон/хв).

Вивченням особливостей використання кисню ембріонами виявлено, що гальмування гліколізу стимулює дихальну активність у ранніх бластоцист на 29,1%, пізніх на 40,2%, у бластоцист без прозорої оболонки – у два рази. При цьому, швидкість відновлення фериціаніду у перших та других зменшується, відповідно, на 69,1% та 56,6%, у третіх – підвищується на 20,7% (63,0±32,0 пкг К₃.../ембріон /хв). Отже, у ранніх та пізніх бластоцист, відповідно, 69,1 та 56,6% і без прозорої оболонки – не більше 21,0% потоку електронів генеруються гліколізом і транспортуються в позаклітинний простір.

При інгібуванні НАД-залежної ділянки дихальна активність бластоцист знижується: ранніх стадій, пізніх та без прозорої оболонки, відповідно, на 66,3, 43,8 та 65,7%. Відновна здатність також знижується у перших на 17,9%, других на 10,5%, а без прозорої оболонки – підвищується більше ніж у два рази (150,0±25,07 пкг К₃.../ембріон/хв). Аналогічно, зі зміною стадії розвитку ембріонів до бластоцисти без прозорої оболонки знижується азидрезистентна компонента дихання з 67,7% до 29,1% та відновна активність на 38,7% і 28,4%.

Інгібітор вільнорадикального окиснення жирних кислот (NaEДTA) гальмує споживання кисню у бластоцист на ранній та пізній стадіях, відповідно, на 59,1% і 67,3%, без прозорої оболонки – на 37,5% (від спожитого кисню азидрезистентною компонентою дихання). Наведені дані свідчать, про наявність в ембріонів альтернативних оксидазних і оксигеназних процесів.

ВИСНОВКИ

У дисертації узагальнено роль окисно-відновних процесів у формуванні та забезпеченні фізіологічних показників якості і запліднювальної здатності сперміїв бугаїв in vivo та in vitro, дозріванні ооцитів, їх заплідненні та розвитку ембріонів корів in vitro. Вивчено перебіг та регуляцію окисно-відновних процесів при дозріванні і капацитації сперміїв поза організмом, ооцитів – у процесі дозрівання та після запліднення – росту ембріонів, виявлені чинники, які забезпечують оптимальне співвідношення процесів окиснення та відновлення у статевих клітинах, встановлені маркери інтенсивності вказаних процесів. На підставі результатів досліджень, розроблені практичні пропозиції з об’єктивного і вірогідного оцінювання якості статевих клітин бугаїв і корів, корекції інтенсивності окисно-відновних процесів у сперміях та ооцитах, підвищення запліднювальної здатності сперміїв, запліднення корів і телиць in vivo та ооцитів – in vitro.

1.          Спермії свіжоотриманих еякулятів чорно-рябих бугаїв молочних порід характеризуються такими біохімічними та фізіологічними показниками: інтенсивність використання кисню 5,3–60,7 нг-атом О/10⁸ сперміїв/хв, швидкість відновних процесів 0,1–26,0 мкг К₃…/10⁸сперміїв/хв, активність СДГ 0,5–55,0 мкМ/хв/л, ЦХО 0,5–100,0 мкМ/хв/л, вміст фракцій білків – альбуміну 5,5–38,9%, глобулінів: a- 15,1–69,1%, b- 4,0–32,1%, g- 12,2–54,0%, аскорбінової кислоти 5,0–110,0 мкг/мл, продуктів окиснення (дегідроаскорбінової і дикетогулонової кислот) 0,5–45,0 мкг/мл та сумарний вміст 5–150,0 мкг/мл. Величини біохімічних і фізіологічних показників проявляють значну мінливість внаслідок індивідуальних особливостей плідників, черговості отримання еякулятів, сезону року, віку, походження бугаїв, інших факторів.

2.          У спермі бугаїв існують позитивні кореляції сильні (h = 0,70–0,74) та середньої сили (h = 0,46–0,65) між інтенсивністю використання кисню, мітохондріальною та азидрезистентною компонентами, активністю окисних ферментів. Неоднозначна сила взаємозв’язків між корелюючими біохімічними показниками свідчить про інтенсивність окисно-відновних процесів і визначає фізіологічні показники сперміїв. Сильна кореляція (h = 0,70–0,71) між активністю СДГ, ЦХО і фізіологічними показниками сперміїв дає підстави до використання обох ферментів для оцінювання якості та запліднювальної здатності сперміїв свіжоотриманих і розморожених еякулятів бугаїв.

3.          У спермі бугаїв існує оптимум окисно-відновних процесів та показників, а саме, дихальна активність 17,3–20,9 нг-атом О/10⁸сперміїв/хв, її компоненти: мітохондріальна 8,5–10,4 та азидрезистентна 9,9–12,7 нг-атом О/10⁸сперміїв /хв, активність ЦХО 31,8–36,7 і СДГ 14,9–17,5 мкМ/хв/л, вміст аскорбінової кислоти і продуктів окиснення 41–50 і менше 10 мкг/мл, альбуміну 15–20%, глобулінів: a- 30–50%, b- і g- менше, відповідно, 15 і 25%. Оптимум вказаних процесів і показників характерний для еякулятів за об’ємом 2,0–6,0 мл, концентрацією сперміїв 0,60–1,40Ч10⁹ /мл і кількістю живих 60–80%, що забезпечують виживання сперміїв у свіжоотриманих еякулятах (+46,5°C) 72,7–126,5 хв, розморожених (+38°С) 312,0–373,9 хв, резистентність, відповідно, 22,5–44,5 і 11,3–32,4 тис.

4.          ”Окисне навантаження” в еякулятах бугаїв зменшує використання кисню сперміями та відновну активність, підвищує чутливість ланок дихального ланцюга до інгібіторів. Відновлена форма глутатіону нівелює вплив т-БГП на окисно-відновні процеси у сперміях, стимулює їх інтенсивність при окисненні ендо- та екзогенних субстратів, забезпечує захист від факторів зовнішнього середовища та зберігає метаболічну активність енергогенеруючих ланок. Аскорбінова кислота, стимулює транспорт електронів у дихальному ланцюзі і окисні процеси не пов’язані з синтезом АТФ. Аскорбінова кислота чи відновлена форма глутатіону, додані по 2,50 мМ або у поєднанні (аскорбінова кислота : відновлена форма глутатіону) 1,25+2,50 мМ до свіжоотриманої розбавленої сперми, забезпечують у процесі інкубування за температури + 46,5°С показники виживання сперміїв 77,1–94,3 хв та збереженості 33,2–48,7%. Аскорбінова кислота та відновлена форма глутатіону 0,35:2,5 мМ додані до розріджувача сперми, підвищують запліднювальну здатність сперміїв.

5.          Інкубування сперміїв, отриманих із придатка сім'яника, у середовищі з гомогенатом слизової матки корови, фолікулярною рідиною, гепарином забезпечує максимальну кількість їх з морфологічними та біохімічними показниками, характерними для акросомної реакції та капацитації: втрачається розділення між акросомою та головкою, інтенсивно поглинають кисень та зростають інтенсивність мітохондріального та немітохондріального дихання, відновна здатність, підвищується активність Г-6-ФДГ, СДГ (активних сперміїв). Значні коливання величин досліджуваних показників у зв’язку з факторами капацитації свідчать про відмінності сперміїв до дозрівання in vitrо і різну запліднювальну здатність.

6.          У процесі інкубування сперми та капацитації сперміїв знижується вміст альбуміну на 2,6–23,7% і a-глобулінів на 5,9%, підвищується – g-глобулінових фракцій на 0,5–15,3%. Зміни білкового спектру свіжоотриманої інкубованої сперми залежать від величин показників якості еякулятів і активності СДГ. Для капацитованих сперміїв характерне зростання вмісту білків з ММ 14,4, 30,0, 67,0 і більше 94,0 кДa та зменшення – 20,1 і 94,0 кДa. У збережених пробах (сперміях і супернатанті) знижується вміст білків у зонах ММ від 30,0 до 45,0 та від 67,0 до 94,0 кДa і підвищується – від 45,0 до 67,0 кДa.

7.          Висока ооцитпродуктивність характерна для яєчників “раннього” та “пізнього” жовтого тіла (3,0–3,4 ОКК з одного яєчника) і менша (2,4 ОКК) – “фолікулярного зростання” та “свіжої овуляції”. Існує сильна позитивна кореляція (h = 0,81) між кількістю вилучених ооцитів і розміром фолікулів менше 4мм.

8.          У фолікулярній рідині яєчників корів вміст загального білка становить 6,4–7,8 г%, альбумінів 33,6–44,5%, глобулінів (%): б- 9,5–14,1, в- 13,8–18,5, г- 30,0–42,3, глікопротеїнів у складі фракцій: альбуміну 5,4–33,1% і глобулінів: б- 12,7–28,4, в- 13,9–21,7, г- 27,3–60,4. Величини наведених показників у фолікулярній рідині залежать від розміру фолікулів (h = 0,10–0,72) та фізіологічного стану яєчників корів (h = 0,11–0,66). Яєчник зі “свіжою” овуляцією характеризується високим вмістом g- глобулінів 32,4–42,3% і глікопротеїнів 56,6–68,9%.

9.          Активність клітин гранульози становить: дихальна – 8,1–25,1 нг-атом О/ 0,1мл СК/хв, відновна – 0,4–2,3 мкг К₃.../мл СК/хв. Значення показників залежать від розміру фолікулів і становлять: дихальна – малий фолікул 8,1–18,1; середній – 8,2–17,0; великий – 8,7–13,5 нг-атом О/0,1мл СК/хв і відновна, відповідно, 0,7–2,3; 0,6–1,9; 0,4–0,7 мкг К₃.../мл СК/хв. Інтенсивність окисно-відновних процесів у клітинах гранульози залежить від фізіологічного стану яєчників корів. Енергетичні потреби клітин гранульози, в залежності від розміру фолікулів та фізіологічного стану яєчників корів, забезпечуються гліколізом на 9,9–42,3% і диханням – 27,2–47,6%. Із загальної кількості використаного кисню 26,5–55,5% припадає на ціанід-(азид-) резистентне дихання.

10. Інтенсивність окисно-відновних процесів у клітинах гранульози характеризує розвиток та дозрівання ооцитів у яєчниках корів: “очікування“ – низькі величини дихання (8,1–8,8 нг-атом О/0,1мл СК/хв), NаЕДТА-компоненти (0,2–0,9 нг-атом О/0,1мл СК/хв) і відновної здатності (0,6–0,8 мкг К₃.../мл СК/хв) у яєчнику “свіжої овуляції”; “дестабілізації” – зростання дихання (до 13,5–25,1 нг-атом О/ 0,1мл СК/хв) та ціанідрезистентної компоненти (до 1,0–3,4 нг-атом О/0,1мл СК /хв), відновної здатності (до 0,7–2,3 мкг К₃.../мл СК/хв) – “раннє” жовте тіло; “стабілізації” – збереження високих значень споживання кисню (12,2–18,1 нг-атом О/ 0,1мл СК/хв), зниження відновної здатності (0,7–0,9 мкг К₃.../мл СК/хв), NаЕДТА-компоненти дихання (0,1–0,4 нг-атом О/0,1мл СК/хв) – “пізнє” жовте тіло; “гальмування” – зниження дихання (8,8–15,6 нг-атом О/0,1мл СК/хв), ціанідрезистентної компоненти (0,2–2,9 нг-атом О/0,1мл СК/хв), відновної здатності (0,4–1,2 мкг К₃.../мл СК/хв), зростання NаЕДТА-чутливої компоненти дихання (1,0–1,6 нг-атом О/0,1мл СК/хв) – “фолікулярне зростання”. На ранніх етапах розвитку фолікула клітини гранульози виявляють більший вплив на ооцит у зв’язку зі значним використанням субстратів для росту. З нагромадженням поживних речовин відбувається зворотна реакція, що зумовлює інгібуючий вплив ооцита на інші клітини.

11.        Антральна рідина фолікулів корів характеризується вмістом відновлених форм глутатіону 17,3–33,7 мг% і аскорбінової кислоти – 10,0–21,2 мкг /мл, окислених, відповідно, 10,0–19,1 мг% і 8,3–14,7 мкг/мл. Загальний вміст становить: глутатіону – 27,0–51,4 мг%, аскорбінової кислоти з продуктами окиснення – 21,9–34,0 мкг/мл. Переважна частина загального глутатіону (78,7%) та його відновленої форми (68,2%) локалізовані у клітинах із антральної рідини, а аскорбінової кислоти (76,0%) та загальний вміст (86,9%) – у фолікулярній рідині. Вищі значення абсолютних величин глутатіону та аскорбінової кислоти у малих фолікулах яєчників забезпечують інтенсивний міжклітинний обмін і ріст ооцитів. У великому та середньому фолікулах яєчника “свіжої овуляції” вміст відновленої форми глутатіону 53,9–59,1%, окисненої 40,9–46,1%, аскорбінової кислоти і продуктів окиснення, відповідно, 55,4–57,6% і 49,2–47,5%, свідчить про нагромадження цитотоксичних сполук в екзо- і ендоцелюлярному просторі клітин, що негативно впливає на якість ооцитів і придатність їх для використання в репродуктивній біотехнології.

12.        Інтенсивність дихання ооцит-кумулюсних комплексів становить (нг-атом О/ооцит/хв) у середовищі Дюльбеко – 0,12±0,03, ТС 199 – 0,22±0,04, Іґла – 0,27±0,04 та RPMI-1640 – 0,32±0,06. Зв’язок між компактністю кумулюсного оточення та інтенсивністю поглинання кисню ооцитами у вказаних синтетичних середовищах свідчить про їх здатність використовувати ендо- і екзогенні субстрати та АТФ при культивуванні. Середовище RPMI-1640 забезпечує інтенсивне дихання ооцитів після вилучення із фолікулів і через 24 год інкубування.

13.        Використання середовища RPMI-1640 з гомогенатом слизової верхньої третини рогу матки корови і виконання робіт у два етапи: 1) культивування та запліднення ооцитів, 2) вирощування ембріонів – забезпечує одержання великої кількості життєздатних ембріонів корів і повноцінний розвиток їх до стадії бластоцисти.

14.        Окисно-відновні процеси бластоцист характерні такими показниками: використання кисню – ранніми 0,09±0,01, пізніми 0,10±0,03, без прозорої оболонки 0,11±0,02 нг-атом О/ембріон/хв, відновна активність, відповідно, 37,0±9,00, 29,00±12,10 та 13,0±2,01 пкг К₃.../ембріон/хв. Величини значень наведених показників залежать від стадій розвитку: пряма залежність – між стадією розвитку бластоцист та інтенсивністю споживання кисню і, обернена – зі швидкістю відновлення фериціаніда. У ранніх та пізніх бластоцист від 69,1 до 56,6%, а у бластоцист без прозорої оболонки – 21,0% потоку електронів генеруються гліколізом і транспортуються у позаклітинний простір.

ПРОПОЗИЦІЇ ВИРОБНИЦТВУ

1.         З метою об’єктивного, прискореного оцінювання і прогнозування запліднювальної здатності сперми бугаїв проводити у лабораторіях племпідприємств визначення кількості живих сперміїв полярографічним методом з використанням інгібітора мітохондріального дихання, а також активності сукцинатдегідрогенази чи цитохромоксидази у свіжоотриманій або розмороженій спермі. Для забезпечення високої ефективності штучного осіменіння корів і телиць відбирати еякуляти з показниками активності сукцинатдегідрогенази не нижче 15,0 мкМ/хв/л чи цитохромоксидази не нижче 30,0 мкМ/хв/л.

2.         Для збереження життєздатності, підвищення виживання і запліднювальної здатності сперміїв у процесі підготовки сперми бугаїв до заморожування використовувати у розріджувачі аскорбінову кислоту і відновлену форму глутатіону у відношенні 0,35 : 2,5 мМ (61,6 мг аскорбінової кислоти : 765 мг відновленої форми глутатіону на 1000 мл розріджувача).

3.         Для створення належних умов дозрівання ооцитів корів in vitro, запліднення та отримання ембріонів відбирати ОКК з компактним кумулюсом фолікулів діаметром менше 7 мм з яєчників фізіологічного стану ”раннього” та ”пізнього” жовтого тіла, що забезпечує оптимальну інтенсивність окисно-відновних процесів, використання енергетичних субстратів середовищ.

4.         Для підвищення ефективності роботи з репродуктивної біотехнології процеси культивування, запліднення ооцитів та вирощування ембріонів проводити у два етапи: культивування (16–18 год) і запліднення (16–18 год) у середовищі RPMI-1640, з додаванням до нього: 10% фолікулярної рідини, 10% еструсної сироватки крові корів, 10% фетальної сироватки крові, клітин гранульозного шару (5–7 Ч 10⁶/мл з антральних фолікулів діаметром до 4 мм без ознак атрезії), 0,03% інсуліну (0,13 од/мл), 0,001% гепарину (5 од/мл). Заміну середовища проводити перед заплідненням та після 16–18 годинного спільного культивування ооцитів і сперміїв. Вирощування бластоцист проводити в середовищі RPMI-1640, до якого, крім вказаних компонентів, додавати 10% гомогенату слизової з верхньої третини рогу матки корів. Заміну середовища проводити через кожні 48 годин протягом культивування.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

 

МОНОГРАФІЇ, БРОШУРИ І ДОВІДНИКИ

 

1.     Фізіолого-біохімічні методи досліджень у біології, тваринництві та ветеринарній медицині (видання третє, перероблене і доповнене). Довідник / В. В. Влізло, Р. С. Федорук, І. А. Макар, І. Б. Ратич, Л. І. Сологуб, В. Г. Янович, ... Д. Д. Остапів та ін. Ї Львів: Інститут біології тварин, 2004. Ї 400 с. (Дисертант написав методики досліджень сперми до розділу 11.Ї С. 257–263.)

2.     Остапів Д. Д. Способи оцінювання якості еякулятів бугаїв та підвищення запліднювальної здатності сперміїв / Д. Д. Остапів // Методичні рекомендації. Ї Київ, 2008. Ї 24 с.

СТАТТІ У НАУКОВИХ ВИДАННЯХ

 

3.     Чухрій Б. М. Колориметричний спосіб визначення активності сукцинатдегідрогенази в спермі бугаїв / Б. М. Чухрій, Л. О. Клевець, Д. Д. Остапів // Вісник аграрної науки. Ї 1995. Ї № 11. Ї С. 73–76. (Дисертант брав участь у плануванні і проведенні експерименту, оформленні роботи до друку).