Микробиологическая диагностика

2. Микробиологическая диагностика

Она основана на выделении из исследуемого материала возбудителя и обнаружении моноспецифического токсина. Исследуют кровь, выделения больного (содержимое желудка или промывные воды, мочу и испражнения), продукты, вызвавшие отравление, и трупный материал, почву, овощи, фрукты, воду и пр. Возбудители обнаруживаются с помощью посевов на среды, а токсин — биологической пробой и реакцией нейтрализации на животных. Для освобождения от сопутствующей микрофлоры одну часть материала перед посевом прогревают при 80° в течение 30 мин., а другую высевают па среды нагретой. Промывные воды и фекалии сеют в количестве 20—25 мл. Мочу и кровь (5—25 мл) высевают на среды без прогревания. Посевы производят на среду Тароцци, пепсин-пептон с 0,5—I % глюкозы и кусочками печени, для выделения типов С, U и Е — на бульон Хотингера с глюкозой и кусочками мяса или печени. Посевы производят в широкие пробирки или (лучше) во флаконы с 200—250 мл среды. Посевы выращиваются под слоем вазелина в обычном термостате при 30—35° в течение 6—10 дней. Для получения токсина Е выращивание производит при 25—28°.

Для обнаружения токсина первая промывная вода из желудка больного вместе с кусочками пищи, собранная в стеклянную посуду, переносится в стерильную ступку, где кусочки пищи тщательно растирают, затем все собирают в пробирку или колбу и 2 часа экстрагируют при комнатной 1°. Экстракт фильтруют или центрифугируют, прозрачную жидкость используют для постановки реакции на токсин. В крови больного токсин выявляют после центрифугировании для осаждения эритроцитов. Моча для реакции на токсин предварительно не обрабатывается.

Испражнения в количестве 10—15 г собирают в стерильную ступку или стакан, заливают двойным объемом физиологического раствора и ставят на 1—2 часа в прохладное место для экстрагирования токсина. Затем жидкость фильтруют или центрифугируют и используют для реакции на токсин. При исследовании трупов из каждого органа берется стерильно по 2—3 кусочка но 5—10 г и кровь (10—15 мл). Наиболее часто токсин обнаруживают в печени.

Бактериологическое исследование продуктов производится для определения их обсемененности бактериями ботулизма и пригодности для производства консервированных продуктов. Образцы свежей, соленой, копченой рыбы, балыков, ветчины, колбасы и других продуктов должны быть весом около 200—250 г. Консервы, главным образом давшие бомбаж, берутся отдельными коробками. Коробки перед посевом моют горячей водой с мылом, обжигают горящим спиртом и стерильно вскрывают, из них засевают продукты и имеющийся соус. Образцы надо брать в местах, вызывающих сомнение в доброкачественности продукта. Из середины каждого образца стерильно вырезают кусочки, размельчают и по 20—25 г засевают в 200—250 мл среды. Для обнаружения ботулинических токсинов в пищевом продукте его берут на исследование в подозрительных местах по органолептическим показаниям в количестве 20—25 г. Если продукт соленый, его растирают в стерильной ступке с двойным объемом дистиллированной воды или физиологического раствора и оставляют при комнатной температуре па 2 часа для экстрагирования токсина, после этого ставят реакцию.

Выделение микробов ботулизма из почвы представляет значительные трудности. Почва для исследования берется на глубине 5— 10 см в количество 100—150 г в стерильную посуду, закрытую резиновой или притертой пробкой, и хранится в прохладном месте. Для навески почвы одного образца по 20—25 г размельчают в стерильных ступках с двумя объемами физиологического раствора. Суспензию одной навески засевают во флакон или колбу с 200— 250 мл среды, не прогревая. Другую навеску в колбе прогревают на водяной бане при 80° в течение часа. Если хотят убить в почве споры всех слабоустойчивых к температуре бактерий, то суспензию нагревают при 100° в течение 10—20 мин. и после этого засевают на 200—250 мл среды. Из посевов почвы в дальнейшем изучаются только то, культуральная жидкость которых убивает мышь в дозе 0,1—0,25 мл, а морскую свинку — 2,3—3,0 мл.

Посевы исследуемого материала изучают бактериоскопически через 2—3 суток и при обнаружении подозрительных бактерий ставят с культуральной жидкостью на 2—4 мышах предварительную реакцию нейтрализации с поливалентной ботулинической диагностической сывороткой. Одной или двум мышам вводят подкожно 1.0 мл культуральной жидкости, смешанной с 1,0 мм поливалентной сыворотки, содержащей по 100—500 АЕ антитоксина каждого типа. Окончательное заключение о присутствии токсинов в посевах делается на 6—10 сутки. Выделение чистой культуры производят из посева гретого и нагретого материала. В первых посевах бактерии в чистой культуре могут оказаться нетоксигенными. Необходимы многократные пересевы их на различных средах для подбора наиболее оптимальной среды для токсинообразования. Если в посевах имеется ботулинический токсин, в первых генерациях не следует производить полную очистку штамма от сопутствующих бактерий; это может привести к потере токсигенности. Выделение чистой культуры типов С, U u Е представляет большие "трудности.

Биологическую пробу и реакцию нейтрализации со специфическими диагностическими сыворотками типов А, В, С, D и Е обычно ставят на мышах и морских спинках. Экстракты из исследуемого материала делят на 2 части. Одну из них кипятят в водяной бане в течение 20—30 мин. для разрушения токсина. Постановка биологической пробы является ориентировочным исследованием и сводится к тому, что каждый образец кипяченой и некипяченой жидкости вводят двум мышам внутривенно по 0,5 или подкожно по 1,0 мл. Двум морским свинкам (весом по 300—350 г) вводят подкожно по 2—5 мл жидкости — одной свинке кипяченую жидкость, а другой — некипяченую. Если в жидкости содержится ботулинический токсин, животные, получившие некипяченую жидкость, погибают, а получившие кипяченую — остаются живыми.

Заключение о присутствии ботулинического токсина в каком-либо субстрате можно сделать только на основании реакции нейтрализации. Берут 6 Пробирок, в каждую наливают по 1,0 мл исследуемой жидкости, затем в пробирки вносят по 1 мл сыворотки: в первую — типа А, во вторую — В, в третью — С, в четвертую — D, в пятую — Е, в шестую, контрольную пробирку, добавляют 1 мл физиологического раствора. Перед прибавлением сыворотку разводят физиологическим раствором до содержания 100—200 АЕ в 1 мл. После добавления сыворотки пробирки слегка встряхивают, и смесь оставляют на 30— 40 мин. на столе или ставят в термостат при 37° для нейтрализации токсина. Смесь жидкости и сыворотки каждого тина вводят двум мышам внутривенно по 0,5 мл или по 1 мл подкожно. При наличии токсина погибают контрольные мыши, получившие одну жидкость. Остаются живыми лишь те мыши, которые получили жидкость с нейтрализованным токсином, что позволяет определить типовую его принадлежность. Для постановки этой реакции на морских свинках в каждую пробирку вносят по 4 мл жидкости и для нейтрализации токсина по 4 мл сыворотки, животным вводят подкожно по 6 мл этой смеси. Окончательный учет результатов реакции производят на 4—5-й день. Видовая и типовая принадлежность нетоксичных чистых штаммов бактерий ботулизма может быть ориентировочно определена с помощью реакции агглютинации с сывороткой типов А, В, С, D и Е.