Роль эндофрина в нейроэндокринной регуляции функций иммунной системы

На правах рукописи

Гейн Сергей Владимирович

РОЛЬ b-ЭНДОРФИНА В НЕЙРОЭНДОКРИННОЙ РЕГУЛЯЦИИ ФУНКЦИЙ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ

14.00.36 Аллергология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Пермь - 2007

Работа выполнена в аналитической лаборатории Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь.

Научный консультант:

академик РАН и РАМН, д.м.н., профессор

Черешнев Валерий Александрович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Сибиряк Сергей Владимирович,

доктор медицинских наук, профессор Кузнецов Валериан Фёдорович,

доктор медицинских наук, профессор Юшков Владимир Викторович

Ведущая организация: Институт экспериментальной медицины РАМН, Санкт-Петербург.

Защита состоится «__»__________ 2007 г. в ____ часов на заседании диссертационного совета Д 004.019.01 в Институте экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН по адресу: 614081, г. Пермь, ул. Голева, 13. Факс (342)2446711.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь.

Автореферат разослан «___» _______________2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

чл.-корр.РАН Ившина Ирина Борисовна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Поддержание внутреннего гомеостаза определяется взаимодействием нервной, эндокринной и иммунной систем организма. Известно, что иммунная система многокомпонентна, ее функционирование обеспечивается сложной сетью взаимосвязанных сигналов. Одними из важнейших посредников во взаимодействии нервной и иммунной систем выступают эндогенные опиоидные пептиды, представляющие собой группу факторов и играющих ключевую роль в процессах адаптации организма (Корнева, Шхинек, 1988; Зозуля, Пшеничкин, 1990; Корнева, 2007; Maier, 2003; Pruett, 2003; Bodnar, Klein, 2006; Sharp, 2006; Wilbert-Lampen et al., 2007). Несмотря на то, что в последние годы изучению влияния эндогенных опиоидных пептидов на процессы регуляции иммунитета в литературе уделяется достаточно много внимания (Panerai, Sacerdote, 1997; Tomassini et al., 2003, 2004; Sacerdote, 2003), вопрос о механизмах реализации эффектов биорегуляторных пептидов данного класса остается крайне актуальным.

Основной источник опиоидных пептидов в организме - центральная нервная система. Основная группа пептидных гормонов (адренокортикотропный гормон, b-липотропин, меланоцитстимулирующий гормон, b-эндорфин) образуется в результате расщепления большой молекулы – предшественника проопиомеланокортина. При этом наиболее активным и полифункциональным представителем пептидов группы проопиомеланокортина является b-эндорфин. Основной источник b-эндорфина в центральной нервной системе – аркуатное ядро гипоталамуса, на периферии – промежуточная доля гипофиза, из которой пептид секретируется в кровь при стрессе, шоке, травмах и физических нагрузках. b-эндорфин является ключевым фактором, осуществляющим контроль стрессиндуцированных изменений иммунитета со стороны эндогенной опиоидной системы (Зозуля, Пшеничкин, 1990; Pedersen, Hoffman-Goetz, 2000). Роль других соединений из семейства эндогенных опиоидных пептидов, в частности энкефалинов, при стрессе значительно более скромна, а по мнению отдельных авторов (Owens, 1987) вообще отрицается.

Известно (Panerai, Sacerdote, 1997), что изменение концентрации b-эндорфина в головном, спинном мозге и гипофизе часто сочетается с неврологическими и аутоиммунными нарушениями (мигрень, рассеянный склероз, болезнь Крона). Важную роль b-эндорфин играет в патогенезе инфекционных заболеваний, модулируя функции клеток адаптивного и естественного звеньев иммунной системы при их контакте с микроорганизмами и вирусами (Ляшев, 2000; Plotnikoff, 1999; Sitte et al., 2007). В связи с этим изучение роли b-эндорфина в регуляции иммуногенеза представляет большой интерес.

Широкий спектр биологической активности b-эндорфина определяется его способностью взаимодействовать с различными по своей природе сайтами связывания, к которым относятся опиоидные (налоксон-чувствительные) и неопиоидные (налоксон-нечувствительные) рецепторы. Экспрессия опиатных рецепторов трёх основных классов (µ, d, k) и неопиоидного рецептора на клетках различных органов и тканей, в том числе и клетках иммунной системы, доказана методами радиолигандного связывания и детекции соответствующей РНК (Наволоцкая и др., 2004; Madden, 1995; Plotnikoff, 1999; Bidlack, 2000; Kraus et al., 2006; Lotsch et al., 2006; Sharp, 2006). Подобное распределение участков связывания b-эндорфина объясняет широкий спектр активности данного пептида и указывает на возможность как прямого, так и опосредованного влияния на формирование иммунного ответа (Зозуля, Пшеничкин 1990; Bidlack, 2000; Stanojević et al., 2006).

Нерешенными остаются вопросы, касающиеся изучения роли эндогенной опиоидной системы в стрессиндуцированных изменениях гуморального и клеточноопосредованного иммунитета; различных рецепторов в регуляции выраженности иммунных процессов, индуцируемых эндогенными опиоидами при стрессе, а также на фоне введения двух основных стрессреализующих факторов – глюкокортикоидов и катехоламинов. Малоизученными остаются молекулярные и клеточные механизмы иммунорегуляторного действия b-эндорфина, связанные с эффектами данного гормона на процессы пролиферации, кооперации и дифференцировки клеток иммунной системы, продукцию ряда ключевых цитокинов (g-IFN, IL-4, IL-10, IL-12), являющихся маркерными для регуляторных Т-лимфоцитов 1 и 2 типа (Th1/Th2) и определяющих выбор типа иммунного ответа. В литературе имеются довольно противоречивые данные о влиянии b-эндорфина на функции клеток естественного иммунного ответа (Van den Bergh et al., 1994; Peterson et al., 1998; Voccarino, Kastin, 2000; Sacerdote, 2003; Bodnar, Klein, 2006).

Цель настоящей работы – изучение роли опиатергических механизмов в нейроэндокринной регуляции иммуногенеза с оценкой эффектов b-эндорфина на процессы пролиферации, дифференцировки и кооперации клеток иммунной системы.

Основные задачи исследования

1. Изучить роль основных компонентов эндогенной опиоидной системы в регуляции процессов иммуногенеза в условиях острого стресса.

2. Исследовать возможность опосредованности иммунорегуляторных эффектов глюкокортикоидов и катехоламинов через взаимодействие с эндогенной опиоидной системой.

3. Оценить влияние b-эндорфина на функции клеток адаптивного иммунитета и исследовать механизм действия пептида на процессы пролиферации, кооперации и Th1/Th2-дифференцировки лимфоцитов.

4. Изучить роль b-эндорфина в регуляции функций клеток естественного иммунитета.

Научная новизна работы. Экспериментально обоснована интегральная роль эндогенной опиоидной системы в нейроэндокринной регуляции иммуногенеза в норме, в условиях стрессорного воздействии и при введении стрессреализующих гормонов – глюкокортикоидов и катехоламинов. Впервые изучено влияние b-эндорфина на процессы активации, пролиферации, кооперации и Th1/Th2-дифференцировки Т-лимфоцитов с оценкой роли различных клеточных фракций. Выявлен характер участия опиатных рецепторов различных типов в регуляции иммунных реакций под воздействием b-эндорфина и синтетических лигандов опиатных рецепоров пептидной природы. В экспериментах in vivo и in vitro подтверждено, что основной мишенью b-эндорфина является гуморальное звено иммунного ответа, при этом выявлена зависимость эффектов b-эндорфина от фазы развития иммунной реакции. В модели пролиферативного ответа лимфоцитов обнаружена зависимость эффекта b-эндорфина и селективных агонистов m- и d-рецепторов от концентрации митогена и концентрации исследуемых пептидов. Выявлена ключевая роль d-рецепторов в реализации стимулирующего эффекта b-эндорфина на пролиферацию и продукцию IL-4. Впервые установлена зависимость стимулирующего эффекта опиоидных пептидов на пролиферацию лимфоцитов и продукцию IL-4 от присутствия моноцитов в клеточной культуре. Обнаружено, что b-эндорфин снижает степень выраженности реакции бласттрансформации лимфоцитов при удалении моноцитов из клеточной культуры. Показано, что b-эндорфин стимулирует фагоцитарную активность эффекторов естественного иммунитета и оказывает модулирующее влияние на цитокинпродуцирующую функцию моноцитов и нейтрофилов. Изучен характер участия опиатных рецепторов в регуляции этих процессов.

Теоретическая и практическая значимость. Полученные данные расширяют представление о роли b-эндорфина и опиатных рецепторов разных типов в регуляции иммуногенеза. Обосновано, что формирование иммунного ответа в норме и при стрессе, а также регуляция адаптивного и естественного иммунного ответа реализуется за счёт механизмов, связанных с синтезом опиоидных пептидов. Выявлен механизм влияния опиоидных пептидов на процессы Th1/Th2-дифференцировки Т-лимфоцитов. Полученные экспериментальные данные подтверждают целесообразность использования иммуномодулирующих свойств b-эндорфина в терапии ряда аутоиммунных заболеваний (рассеянный склероз, болезнь Крона и пр.). В связи с широким использованием агонистов опиатных рецепторов в практической медицине, необходим учет последствий их применения. Результаты работы используются в лекционном курсе «Экспериментальная иммунопатология и иммунотерапия» на кафедре микробиологии и иммунологии Пермского государственного университета (614990, Пермь, Букирева 15).

Основные положения, выносимые на защиту

1. В условиях блокады опиатных рецепторов выявляется выраженная модификация иммунорегуляторных эффектов ротационного стресса, глюкокортикоидов и катехоламинов.

2. b-эндорфин в высоких дозах угнетает, в низких - стимулирует гуморальное звено иммунитета, и при этом не влияет на выраженность реакции гиперчувствительности замедленного типа. В клеточных культурах b-эндорфин стимулирует пролиферацию лимфоцитов и продукцию IL-4, не влияет на синтез IL-2 и IFN-g, при этом усиливает степень поляризации Т-хелперов в направлении Th2-клеток. В реализации стимулирующих эффектов b-эндорфина на пролиферацию и продукцию IL-4 доминирующая роль принадлежит d-рецепторам.

3. Клетки моноцитарно-макрофагального ряда играют важную регуляторную роль в направленности эффектов b-эндорфина в отношении функциональной активности CD4⁺ лимфоцитов.

4. b-эндорфин стимулирует фагоцитарную активность эффекторов естественного иммунитета и оказывает модулирующее влияние на цитокинпродуцирующую функцию моноцитов и нейтрофилов.

Связь работы с крупными программами. Работа проводилась в течение 2000-2007 гг. в соответствии с планом НИР ИЭГМ УрО РАН (номер госрегистрации темы НИР 01.9.009927); в рамках Программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология»; гранта РФФИ № 06-04-49001, а также грантов молодых учёных Президиума УрО РАН 2003, 2005 гг.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на Международном симпозиуме «Взаимодействие нервной и иммунной систем в норме и патологии», Санкт-Петербург, 2007; V-VIII конференциях с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге», Санкт-Петербург, 2001-2007; ХIХ Российском съезде физиологического общества им. И.П. Павлова с международным участием, Екатеринбург, 2004; VI Международной конференции «Проблемы загрязнения окружающей среды», Пермь-Казань, 2005; III съезде Российского научного общества иммунологов, Екатеринбург, 2004; I-V конференциях иммунологов Урала, Екатеринбург, 2001; Пермь, 2002; Челябинск, 2003; Уфа, 2005; Оренбург, 2006; I-II конференциях молодых учёных «Современные проблемы микробиологии, иммунологии и экологии», Пермь, 1999, 2002.

Публикации. Материалы диссертационной работы обобщены в 46 печатных работах, в том числе 15 экспериментальных статьях и 31 материалах конференций.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 251 странице, содержит 35 таблиц, 49 рисунков и состоит из введения, литературного обзора, описания объектов и методов исследования, 5 глав результатов собственных исследований, обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 448 наименований, в том числе 124 на русском и 324 на английском языках.

Место проведения работы. Работа является частью исследований, выполняемых в аналитической лаборатории ИЭГМ УрО РАН (зав. – к.г.-м.н. М.А. Шишкин) совместно с лабораторией экологической иммунологии (зав. – к.м.н. Б.А. Бахметьев) по изучению механизмов иммуномодулирующих эффектов гормонов, продукция которых изменяется на фоне экологического воздействия. Исследования по проблеме нейроэндокринной регуляции иммуногенеза были инициированы профессором, заслуженным деятелем науки РФ Н.Н. Кеворковым. Научные положения диссертации и выводы, вытекающие из анализа полученного экспериментального материала, базируются на результатах собственных исследований автора.

Автор выражает искреннюю благодарность М.А. Шишкину, к.х.н. С.П. Тендряковой, профессору М.В. Черешневой, за внимание и моральную поддержку. Автор особо признателен сотрудникам группы радиоизотопных исследований к.б.н. Т.А. Баевой, инженеру Е.Г. Чижовой, магистрантам кафедры микробиологии и иммунологии Пермского государственного университета К.Г. Горшковой и И.Л. Шаравьёвой, способствующим завершению настоящей работы и чей вклад в определённые разделы исследований отражён в приведённых в списке литературы публикациях. Автор благодарит главного специалиста Муниципального управления здравоохранением Ростехнадзора, к.м.н. В.Г. Рыжаенкова за помощь в проведении иммуноферментного анализа.

Глубокую благодарность и признательность автор выражает своим учителям и наставникам академику РАН и РАМН В.А. Черешневу и доценту Ю.И. Шилову, оказавшим большое влияние на выбор целей научного поиска и формирование научного мировоззрения автора.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования. В работе использовали белых беспородных мышей массой 20-22 г и лейкоциты периферической венозной крови, полученной от здоровых людей – добровольцев мужского пола в возрасте 19-35 лет. Для экспериментального моделирования реакции стресс использовали ротационную модель. Ротация мышей производилась в течение 60 мин по 10 мин с перерывами по 5 мин при 78 об/мин. Роль опиатных рецепторов в постстрессорных изменениях иммунных реакций исследовали путем их блокады налоксоном гидрохлоридом и налтриндолом гидрохлоридом. Налоксона гидрохлорид (DuPont, США) в разовой дозе 0,2 мг/кг массы тела и селективный антагонист d-опиатных рецепторов налтриндола гидрохлорид (ICN, США) в дозе 0,1 мг/кг вводили животным подкожно однократно за 20 мин до ротации (Ашмарин, 1988; Михайлова и др., 1992; Croock et al., 1992). В дальнейших экспериментах в системе in vivo дозы опиатных антогонистов не изменялись. Иммунизацию животных производили через 1 ч после окончания ротации.

При исследовании иммунорегуляторных эффектов опиоидных пептидов in vivo β-эндорфин (Sigma, США) в диапазоне доз от 100 мкг/кг до 0,0005 мкг/кг вводили однократно внутрибрюшинно в объеме 0,2 мл. Контролем для животных, получавших β-эндорфин, служили мыши, которым вводили по той же схеме 0,9% NaCl. μ-агонист DAGO ([d-Ala²,N-Me-Phe⁴,Gly⁵-ol]-энкефалин и δ-агонист DADLE ([d–Ala²,d-Leu⁵] - энкефалин) (Sigma, США) в диапазоне 10 – 0,0001 мкг/кг вводили по схеме аналогичной введению β-эндорфина. Иммунизацию животных производили через 1 ч после введения опиоидных пептидов.

Гидрокортизона ацетат (Гедеон Рихтер, Венгрия) в дозе 50 мг/кг массы тела вводили однократно внутрибрюшинно. Адреналина гидрохлорид (Московский эндокринный завод, Россия) вводили подкожно однократно в дозе 1 мг/кг. Налоксон и селективный антагонист d-опиатных рецепторов налтриндол вводили подкожно за 20 мин до введения гормонов (3 инъекции через 2,5 ч в группе с гидрокортизоном и 1 инъекция в группе с адреналином). Контролем служили интактные мыши, подвергшиеся иммунизации, но не получавшие препаратов. Дополнительным контролем для животных, получавших гидрокортизон и опиоидные пептиды, служили мыши, получавшие по той же схеме изотонический раствор хлорида натрия. Иммунизацию опытных и контрольных мышей проводили одномоментно через 3 ч от начала эксперимента в группах с гидрокортизоном, через 30 мин - в группах с адреналином.

Для моделирования локального иммунного ответа животных иммунизировали эритроцитами барана (10⁸ клеток вводили подкожно в подошвенную поверхность правой стопы). На 4-е сутки вводили разрешающую дозу антигена (10⁸ клеток). На 5-е сутки оценивали выраженность иммунного воспаления при реакции ГЗТ путём регистрации толщины (инженерным микрометром) и массы (на торсионных весах) опытной и контрольной стопы; количество ядросодержащих клеток (ЯСК); интенсивность антителогенеза методом локального гемолиза в геле агарозы (Jerne, Nordin, 1963). Оценку фагоцитарной активности клеток периферической крови, селезенки, регионарного и отдаленного подколенных лимфатических узлов проводили методом В.Н. Каплина с соавт. (Каплин, 1992, 1996) в модификации (Шилов и др., 1997, 1998).

Нефракционированную клеточную взвесь получали путём отстаивания верхнего слоя плазмы крови с лейкоцитами. Выделение фракции мононуклеаров и нейтрофилов проводили на градиенте плотности фиколл-верографин. Разделение моноцитов и лимфоцитов проводили методом адгезии на чашках Петри. CD4⁺ Т-клетки выделяли при помощи набора магнитных бус Dynabeads M-450 CD4 (Invitrogen, США). Культивирование клеток проводили в течение 24, 48 и 72 ч в пластиковых 24 и 96-луночных планшетах (Orange Scientific, Бельгия) в соответствии с традиционными методиками с использованием полной питательной среды, приготовленной на основе RPMI 1640 или среды 199 (Биолот, Россия) с добавлением 10 mM HEPES, 2 mM L-глутамина (Sigma, США), 100 мкг/мл гентамицина и 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Биолот, Россия) или аутоплазмы во влажной атмосфере с 5% СО₂ при 37⁰С.

Пролиферативную активность оценивали по включению ³H-метилтимидина. Радиоактивность проб определяли на жидкостном сцинтилляционном счетчике Guardian (Wallac, Финляндия). Для определения концентрации IL-1β, TNF-a, IL-6, IL-8, IL-1ra, IL-2, IL-4 и IFN-γ в супернатантах культур клеток использовали спектрофотометр Униплан (Пикон, Россия) и иммуноферментные тест-системы производства ООО Протеиновый контур, ООО Цитокин, Санкт-Петербург, Вектор-Бест, Новосибирск. В экспериментах in vitro использовали агонист δ,μ-опиатных рецепторов β-эндорфин в концентрациях 10^-7-10^-12М; меланотропин потенцирующий фактор (MPF) - фрагмент 88-91 β-липотропина (Lys-Lys-Gly-Glu) в концентрациях 10^-7-10^-12М; μ-агонист опиатных рецепторов DAGO ([d-Ala²,N-Me-Phe⁴,Gly⁵-ol]-энкефалин) в концентрациях 10^-7– 10^-12М; δ-агонист опиатных рецепторов DADLE ([d–Ala²,d-Leu⁵]-энкефалин) в концентрациях 10^-7–10^-12М; неселективный антагонист опиатных рецепторов налоксона гидрохлорид и селективный антагонист δ-рецепторов налтриндола гидрохлорид в концентрациях 10^-6, 10^-8, 10^-10М; липополисахарид (ЛПС) Escherichia coli O26:B6 - 0,1 мкг/мл (Sigma, США), фитогемагглютинин (ФГА) – 1,25; 2,5; 5,0; 10,0; 20,0 мкг/мл (Sigma, США), диклофенак натрия (ДН) 25 мкг/мл, моноклональные анти-IL-1b антитела – 2 мкг/мл.

Полученные данные обрабатывали с помощью многофакторного дисперсионного анализа для парных данных и корреляционного анализа. Достоверность различий между группами оценивали с помощью t-критерия Стьюдента и критерия Фишера наименьшей значимой разницы. Сортировку и обработку данных проводили на компьютере IBM PC c использованием программ Statistica for Windows 6.0 (Statsoft, Inc., США) и DIASTA (Московский государственный университет, Россия).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Влияние ротационного стресса на показатели иммунитета. Роль опиатных рецепторов. В большинстве опубликованных работ, посвященных изучению влияния стресса на иммунный ответ, исследуются изменения системного иммунного ответа в условиях внутривенной или внутрибрюшинной иммунизации. Принимая во внимание разные компоненты внутрисистемной регуляции общих и локальных форм иммунного ответа, представлялось целесообразным исследование эффектов стресса и блокады опиатных рецепторов в условиях развития локальной формы иммунного ответа.

Как видно из рис. 1, в индуктивную фазу иммунного ответа на фоне стресса наблюдается увеличение числа АОК в лимфатическом узле (ЛУ) и усиление степени выраженности реакции ГЗТ. Блокада δ-опиатных рецепторов приводит к ещё более выраженной активации антителогенеза, в то время как

А Б

 

В Г

 

Рис. 1. Влияние ротационного стресса в условиях блокады опиатных рецепторов на абсолютное (А) и относительное (Б) число АОК, количество ЯСК в регионарном лимфатическом узле (В) и выраженность реакции ГЗТ (Г) в индуктивную фазу иммунного ответа. Здесь и на рис. 2: * - p<0,05 к контролю; • - p<0,05 к стрессу.

на фоне налоксона стимулирующий эффект ротационного стресса на антителогенез отменяется. Стрессиндуцированное усиление выраженности реакции ГЗТ отменяется как налоксоном, так и налтриндолом. Изолированное введение животным налтриндола или налоксона на количество АОК и степень выраженности ГЗТ влияния не оказывает. В эффекторную фазу иммунного ответа ротационный стресс (рис. 2) стимулирует как клеточный, так и гуморальный ответ, однако, в отличие от индуктивной фазы, на фоне блокады опиатных рецепторов эффекты стресса не модифицируются. Таким образом, стимуляция опиатных рецепторов в индуктивную фазу иммунного ответа играет важную роль в стрессиндуцированных изменениях иммуногенеза и ответственна за активацию функций иммунной системы при стрессе.

Влияние гидрокортизона и адреналина на локальный иммунный ответ в условиях блокады опиатных рецепторов. В процессе развития стрессреакции основные стрессреализующие факторы глюкокортикоиды,

А Б

 

В Г

 

Рис. 2. Влияние ротационного стресса в условиях блокады опиатных рецепторов на абсолютное (А) и относительное (Б) число АОК, количество ЯСК в регионарном лимфатическом узле (В) и выраженность реакции ГЗТ (Г) в эффекторную фазу иммунного ответа.

Таблица 1. Влияние гидрокортизона в условиях блокады m- и d-опиатных рецепторов на число АОК, количество ЯСК в лимфатическом узле и выраженность реакции ГЗТ в индуктивную фазу иммунного ответа

Экспериментальное воздействие	Лимфатический узел
	ЯСК на орган (´106)	log10 АОК на 106 ЯСК	log10 АОК на орган
Интактные животные (контроль), n=19	8,93±1,35	2,15±0,15	3,01±0,17
		(142)	(1014)
Физиологический	7,79±1,08	2,27±0,16	3,10±0,13
раствор, n=16		(186)	(1252)
Гидрокортизон, n=19	4,98±0,68*#	1,64±0,23	2,17±0,25*#
		(43)	(149)
Гидрокортизон	6,71±0,75a	0,96±0,21*#a	1,50±0,31*#
+Налоксон, n=15		(9)	(32)
Гидрокортизон	5,87±0,71	0,55±0,14*#a	1,07±0,22*#a
+налтриндол, n=17		(4)	(12)
Налоксон, n=10	7,76±1,27	2,24±0,08	3,07±0,14
		(173)	(1187)
Налтриндол, n=12	8,38±1,37	1,93±0,11	2,79±0,11
		(86)	(622)

Примечание. Здесь и в табл. 2, 3, 4 в скобках указана средняя геометрическая числа АОК (антилогарифм из средней арифметической log₁₀ числа АОК). * - p<0,05 к контролю; # - p<0,05 к физиологическому раствору; а - p<0,05 к гидрокортизону по непарному t-критерию Стъюдента..

катехоламины и эндогенные опиоиды находятся в тесной взаимосвязи и оказывают друг на друга взаимное регуляторное влияние (O`Connor, 2000). Как видно из табл. 1, в индуктивную фазу иммунного ответа гидрокортизон снижает количество ядросодержащих клеток в лимфатическом узле и абсолютное число АОК. При введении гидрокортизона на фоне блокады опиатных рецепторов налоксоном и налтриндолом регистрируется отмена индуцированного гидрокортизоном снижения количества ЯСК и ещё более выраженное угнетение антителогенеза по абсолютным и относительным показателям,

Таблица 2. Влияние адреналина в условиях блокады m- и d-опиатных рецепторов на число АОК, количество ЯСК в лимфатическом узле и выраженность реакции ГЗТ в индуктивную фазу иммунного ответа

Экспериментальное воздействие	Лимфатический узел
	ЯСК на орган (´106)	log10 АОК на 106 ЯСК	log10 АОК на орган
Интактные животные (контроль) n=11	6,29±1,04	2,43±0,16	3,15±0,22
		(268)	(1403)
Адреналин, n=9	5,71±0,74	2,07±0,14	2,79±0,16
		(118)	(618)
Адреналин	7,37±2,08	1,94±0,15*	2,73±0,24
+Налоксон, n=6		(86)	(541)
Адреналин	6,62±1,30	1,78±0,25*	2,45±0,32
+налтриндол, n=11		(60)	(283)
Налоксон, n=10	7,76±1,27	2,24±0,08	3,07±0,14
		(173)	(1187)
Налтриндол, n=9	8,07±1,82	2,08±1,97	2,90±0,13
		(121)	(803)

особенно ярко проявляющееся в условиях блокады d-рецепторов. Изолированное введение экспериментальным животным налтриндола и налоксона на исследуемые показатели влияния не оказывает. В эффекторную фазу иммунного ответа гидрокортизон угнетает количество ядросодержащих клеток в лимфатическом узле, абсолютное число АОК, однако в отличие от индуктивного периода на фоне блокады опиатных рецепторов эффекты гидрокортизона на показатели клеточности и антителогенеза не модифицируются.

Несколько иная картина наблюдается при анализе эффектов адреналина. Как видно из табл. 2, в индуктивную фазу адреналин оказывает статистически достоверный эффект на антителогенез по относительным показателям (F=5,28; p<0,03), несмотря на то, что при межгрупповом сравнении по отношению к контролю угнетение относительного количества АОК имеет место только при комбинации адреналина с опиатными

Таблица 3. Влияние β-эндорфина на число АОК, клеточность и выраженность реакции ГЗТ в регионарном лимфатическом узле

Экспериментальное воздействие (β-эндорфин)	Число живот-ных	Лимфатический узел			Интенсив-ность ГЗТ
		ЯСК на орган (*106)	Log10 АОК на 106 ЯСК	Log10 АОК на Орган	ИР по массе стопы, % ·
Контроль	9	4,62±0,89	2,43±0,10	3,04±0,01	17,22±2,41
			(271,28)	(1088,94)
100 мкг/кг	9	4,33±0,71	1,98±0,22*	2,57±0,26*	19,84±3,68
			(95,28)	(370,54)
10 мкг/кг	8	5,25±0,70	2,06±0,26	2,76±0,25	23,92±3,46
			(115,56)	(569,35)
1 мкг/кг	9	4,87±1,06	2,46±0,18	3,05±0,16	20,25±4,25
			(286,09)	(1128,59)
0,1 мкг/кг	8	7,55±1,35	2,25±0,18	3,08±0,13	18,82±6,17
			(117,27)	(1198,91)
0,01 мкг/кг	9	5,33±1,13	2,68±0,09	3,34±0,13	26,72±3,88
			(474,99)	(2192,95)
0,001 мкг/кг	8	5,90±1,73	2,62±0,73	3,21±0,13	21,27±4,88
			(421,49)	(1607,54)
0,0005 мкг/кг	9	5,82±0,81	2,87±0,08*	3,61±0,07*	28,72±4,10
			(743,72)	(4031,74)

Примечание. Здесь и в табл. 4: · - индекс реакции (ИР): И.Р. = (Ро–Рк)/Рк·100%, где Ро и Рк - показатели массы в опытной и контрольной конечностях. * - p<0,05 к контролю по t-критерию Фишера наименьшей значимой разницы.

антагонистами. В эффекторную фазу иммунного ответа адреналин на антителогенез в лимфатическом узле не влияет. Таким образом, блокада опиатных рецепторов в индуктивную фазу иммунного ответа приводит к существенной модификации иммунорегуляторных эффектов глюкокортикоидов и катехоламинов, связанной с изменениями секреции β-эндорфина в ответ на введение гидрокортизона или адреналина (Mougey et al., 1986; Bagdy et al., 1989; Goodwin et al., 1992).

Влияние β-эндорфина на показатели клеточного и гуморального иммунитета. Степень выраженности эффектов β-эндорфина в системе in vivo

Таблица 4. Влияние β-эндорфина в условиях блокады опиатных рецепторов на число АОК, клеточность и выраженность реакции ГЗТ в регионарном лимфатическом узле в индуктивную фазу иммунного ответа

Экспериментальное воздействие	Чис-ло жи-во-тных	Лимфатический узел			Интенсив-ность ГЗТ
		ЯСК на орган (´106)	log10 АОК на 106 ЯСК	log10 АОК на орган	ИР по массе стопы, %
Контроль	18	5,34±0,62	2,35±0,10	3,02±0,11	22,43±3,19
			(223,55)	(1043,31)
β-эндорфин	18	4,71±0,51	1,99±0,14*	2,36±0,15*	22,16±2,73
(100 мкг/кг)			(98,80)	(423,03)
β-эндорфин	17	5,98±0,66	2,67±0,07*	3,40±0,08*	27,95±2,73
(0,0005 мкг/кг)			(465,21)	(2519,33)
β-эндорфин	11	5,64±0,97	2,21±0,14	2,87±0,18	23,79±4,27
(100 мкг/кг) +			(161,61)	(747,62)
налоксон
β-эндорфин	12	5,95±0,66	2,16±0,12	2,90±0,14	28,57±6,77
(0,0005 мкг/кг) +			(143,12)	(798,77)
налоксон
β-эндорфин	11	7,18±41,24	2,50±0,07	3,29±0,05*	23,32±4,17
(100 мкг/кг) +			(314,71)	(1945,42)
налтриндол
β-эндорфин	11	9,07±1,24*	2,52±0,09	3,43±0,12*	25,67±3,12
(0,0005 мкг/кг) +			(327,67)	(2673,98)
налтриндол
Налоксон	12	6,40±0,73	2,23±0,09	3,01±0,11	16,08±2,02
			(170,40)	(1013,98)
Налтриндол	8	6,98±0,55	2,04±0,24	2,87±0,21	18,36±1,92
			(110,87)	(755,38)

Примечание. * - p<0,05 к контролю по непарному t-критерию Стьюдента.

напрямую зависит от вводимой дозы пептида (табл. 3). Пептид оказывает разнонаправленный эффект на гуморальный иммунный ответ, угнетающий в дозе 100 мкг/кг и стимулирующий в дозе 0,0005 мкг/кг образование АОК в регионарном ЛУ. При этом статистически достоверного влияния β-эндорфина на клеточность ЛУ и степень выраженности реакции ГЗТ не обнаруживается. Таким образом, β-эндорфин в системе in vivo в зависимости от дозы как усиливает, так и угнетает образование антителопродуцентов.

Данные о влиянии β-эндорфина на фоне блокады опиатных рецепторов представлены в табл. 4. Блокада рецепторов неселективным антагонистом налоксоном отменяет как угнетающий эффект дозы 100 мкг/кг, так и стимулирующий эффект дозы 0,0005 мкг/кг на относительное и абсолютное количество АОК. В то же время введение мышам β-эндорфина на фоне блокады δ-рецепторов налтриндолом по абсолютным показателям не отменяет стимулирующего эффекта низкой (0,0005 мкг/кг) дозы пептида и приводит к увеличение числа АОК в ответ на введение животным высокой дозы (100 мкг/кг). Кроме этого, введение пептида в дозе 0,0005 мкг/кг на фоне налтриндола приводит к статистически достоверному увеличению клеточности ЛУ по сравнению с контролем. На степень выраженности иммунного воспаления комбинация β-эндорфина с антагонистами опиатных рецепторов влияния не оказывает. Таким образом, β-эндорфин в зависимости от дозы оказывает разнонаправленное влияние на образование антителопродуцентов, не влияя

Рис. 3. Влияние DADLE на относительное и абсолютное число АОК, выраженность реакции ГЗТ и клеточность в регионарном лимфатическом узле в индуктивную фазу иммунного ответа.

* - p<0,05; ** - p<0,01; *** - p<0,001 к контролю по t-критерию Фишера наименьшей значимой разницы.

на клеточноопосредованный ответ. Способность пептида взаимодействовать с d-рецептором проявилась только при введении высокой дозы, что, в свою, очередь указывает на возможность реализации через d-рецептор иммуносупрессивных эффектов, напротив блокада m-рецепторов отменяет эффекты пептида независимо от вводимой дозы. В эффекторную фазу влияния β-эндорфина на иммунный ответ не выявляется.

Параллельно нами изучалось сравнительное влияние селективных m и d-агонистов на выраженность локального иммунного ответа. Как видно из рис. 3, в индуктивную фазу иммунного ответа введение d-агониста DADLE в дозах 10,0; 0,1; 0,01 мкг/мл стимулирует количество АОК по абсолютным и относительным параметрам, не влияет на степень выраженности иммунного воспаления (ГЗТ) и оказывает разнонаправленное действие на клеточность регионарного лимфатического узла, при этом в дозе 10 мкг/кг угнетая, а в дозе 0,1 мкг/кг - увеличивая содержание ЯСК. Введение m-агониста DAGO статистически достоверно влияет только на относительное число АОК и клеточность регионарного лимфатического узла. В дозах 10,0; 1,0; 0,0001 мкг/кг пептид активирует образование антителопродуцентов по относительным показателям и в диапазоне доз 10-

Рис. 4. Влияние DAGO на относительное и абсолютное число АОК, выраженность реакции ГЗТ и клеточность в регионарном лимфатическом узле в индуктивную фазу иммунного ответа.

* - p<0,05; ** - p<0,01; *** - p<0,001 к контролю по t-критерию Фишера наименьшей значимой разницы.

0.1 мкг/кг угнетает количество ЯСК (рис. 4). Таким образом, по нашим данным, в системе in vivo эффекты b-эндорфина и аналогов энкефалинов с m,d-селективным спектром связывания DAGO и DADLE значительно варьируют по направленности действия, эффективному диапазону доз, взаимодействию с опиатных рецепторов различных типов, а так же зависят от этапа, на котором конкретный опиоидный пептид вмешивается в развитие иммунных реакций. В то же время наиболее выраженное активирующее влияние наблюдается при введении экспериментальным животным селективного агониста d-рецепторов DADLE.

Влияние β-эндорфина, 88-91 фрагмента липотропина MPF, селективных лигангдов DAGO, DADLE на пролиферативный ответ лимфоцитов. Степень выраженности эффектов исследуемых опиоидных пептидов в системе in vitro зависит от их концентрации и присутствия митогена в культуральной среде. Все лиганды опиатных рецепторов проявляют активность только на стимулированных митогеном культурах. Как видно из рис. 5, b-эндорфин в концентрации 10^-7М статистически значимо усиливает пролиферативный ответ лимфоцитов в культурах с ФГА 5 мкг/мл. Внесение пептида в культуры

 A

Рис. 5. Влияние b-эндорфина (A) и DAGO (Б) на ФГА-индуцированный пролиферативный ответ лимфоцитов.

Здесь и на рис. 6: I - ФГА 5 мкг/мл, II - ФГА 2,5 мкг/мл, III - ФГА 1,25 мкг/мл, IV – без внесения ФГА. Число наблюдений в группах с b-эндорфином n=9, в группах с DAGO - n=8. * - р<0.05 к контролю по парному t-критерию Фишера наименьшей значимой разницы..

в концентрации 10^-8М приводит к стимуляции реакции бласттрансформации в присутствии ФГА 2,5 мкг/мл. Низкие (10^-10, 10^-11М) концентрации b-эндорфина стимулируют пролиферативный ответ в культурах с ФГА 5,0 и 2,5 мкг/мл соответственно. Внесение b-эндорфина в концентрации 10^-12М, отражающей фоновый уровень пептида в плазме крови, не оказывает существенного влияния на пролиферацию лимфоцитов. А.А. Зозулей и С.Ф. Пшеничкиным (1990) высказано предположение, что иммуномодулирующие эффекты b-эндорфина могут проявляться через С-концевой участок пептидной цепи, невзаимодействующий с d-, m-рецепторами. В связи с этим представлял интерес анализ эффектов С-концевого тетрапептида b-эндорфина MPF (меланотропин-потенциирующего фактора) на пролиферативную активность лимфоцитов периферической крови. Как видно из рис. 6, MPF ни в одной из исследуемых концентраций статистически значимых эффектов на спонтанную и индуцированную митогеном пролиферацию лимфоцитов не оказывает. Это позволяет предположить, что выявленный стимулирующий эффект b-эндорфина на пролиферативную активность лимфоцитов не опосредуется через его С-концевой участок.

В связи с тем, что b-эндорфин N-концевой последовательностью связывается как с m-, так и d-опиатными рецепторами и не ясно, какой тип рецепторов в данном случае является основным проводником сигнала с поверхности клетки, мы сопоставили его эффекты на

 A

Рис. 6. Влияние DADLE (А) и MPF (Б) на ФГА-индуцированный пролиферативный ответ лимфоцитов.

Число наблюдений n=8. пролиферацию с эффектами селективных m- и d-агонистов. Данные о влиянии синтетического селективного агониста μ-опиатных рецепторов DAGO на пролиферативную активность лимфоцитов периферической крови представлены в рис. 5. Анализ зависимости эффектов от концентрации показал, что DAGO в высоких и низких концентрациях достоверно усиливает пролиферативный ответ лимфоцитов исключительно в присутствии субоптимальной концентрации (2,5 мкг/мл) митогена. На спонтанный пролиферативный ответ DAGO подобно b-эндорфину влияния не оказывает.

Аналогичные результаты получены при анализе влияния селективного d-агониста DADLE на пролиферацию лимфоцитов (см. рис. 6). Выявлено, что DADLE усиливает включение ³Н-тимидина лимфоцитами по сравнению с контролем в присутствии ФГА 2,5 мкг/мл и высокой концентрации (10^{-7 М) данного пептида.}

В дальнейшем проводилась сравнительная оценка влияния β-эндорфина на пролиферативный ответ на фоне блокады опиатных рецепторов в нефракционированных и фракционированных, очищенных от моноцитов, лимфоцитарных культурах. Как видно из рис. 7, в нефракционированной лейкоцитарной суспензии стимулирующий эффект b-эндорфина на пролиферативный ответ не отменяется, а напротив, усиливается. При удалении моноцитов из фракции мононуклеаров b-эндорфин (F=13,07; p=0,006) и налоксон (F=10,21; p=0,011) оказывают высоко достоверные

Рис. 7. Эффекты b-эндорфина на фоне блокады опиатных рецепторов, DAGO и DADLE на спонтанную (A) и индуцированную ФГА 2,5 мкг/мл (Б) пролиферативную активность лимфоцитов в нефракционированных клеточных культурах.

* - р<0,05 к контролю по парному t-критерию Стъюдента.

самостоятельные эффекты на ФГА-индуцированную пролиферацию, не проявляя статистически значимого взаимодействия между собой (F=4,08; p=0,074). Последующее сравнение средних величин показало, что направленность эффектов опиоидных пептидов противоположна влиянию, оказываемому b-эндорфином и налоксоном в присутствии фракции моноцитов (рис. 8). В частности, выраженное угнетение пролиферации лимфоцитов как по сравнению с контролем, так и с b-эндорфином наблюдается при совместном внесении в культуры b-эндорфина и налоксона. Угнетающий эффект на захват ³Н-тимидина лимфоцитами оказывает селективный m-агонист DAGO. Селективный агонист d-рецепторов DADLE на ФГА-индуцированную пролиферативную активность лимфоцитарной фракции не влияет. При этом эффекты исследуемых опиоидов в аналогичных культурах без митогена не обнаруживаются. Проведенный корреляционный анализ выявил статистически достоверную (r=0,73; р<0,05) зависимость между интенсивностью пролиферации лимфоцитов в нефракционированных культурах под воздействием b-эндорфина и в аналогичных культурах, очищенных от фракции моноцитов.

Анализ роли d-рецепторов в регуляции пролиферативного ответа в нефракционированной лейкоцитарной суспензии и фракции лимфоцитов (рис. 9) показал отмену стимулирующего эффекта b-эндорфина налтриндолом во фракции лейкоцитов. Во фракции лимфоцитов b-эндорфин и налтриндол на степень выраженности пролиферации не влияют, что свидетельствует о возможной

А Б

Рис. 8. Эффекты b-эндорфина на фоне блокады опиатных рецепторов, DAGO и DADLE на спонтанную (A) и индуцированную ФГА 2,5 мкг/мл (Б) пролиферативную активность лимфоцитов в клеточных культурах, очищенных от фракции моноцитов.

* - р<0,05 к контролю по парному t-критерию Стъюдента.

 

А Б

Рис. 9. Эффекты b-эндорфина на фоне блокады d-опиатных рецепторов на индуцированную ФГА 2,5 мкг/мл пролиферативную активность лимфоцитов во фракции лейкоцитов (А) и фракции лимфоцитов (Б).

* - р<0,05 к контролю по парному t-критерию Стъюдента.

реализации стимулирующего эффекта пептида через d-рецептор, но только в присутствии моноцитов.

Учитывая важную регуляторную роль моноцитов, в дальнейшем мы попытались оценить роль IL-1b и продуктов циклооксигеназного цикла в b-эндорфинопосредованной регуляции пролиферативного ответа лимфоцитов в присутствии ФГА (рис. 10А). Все обследованные здоровые доноры были разделены по индивидуальной чувствительности к b-эндорфину на две группы: у 1-й группы пептид стимулировал

Рис. 10. Влияние b-эндорфина на ФГА-индуцированный пролиферативный ответ лимфоцитов в присутствии анти-IL-1b антител и на фоне блокады синтеза простагландинов ДН у доноров 1-й (А, n=9) и 2-й (Б, n=11) групп.

* - р<0,05 к контролю; а - р< 0,05 к анти-IL-1b по парному t-критерию Стъюдента.

пролиферативный ответ, а у 2-й – угнетал. В первой группе доноров на фоне моноклональных антител к IL-1b наблюдается резкое снижение пролиферативной активности, в то же время при внесении в культуры анти-IL-1b-антител в присутствии b-эндорфина наблюдается некоторое усиление пролиферативного ответа, достоверно отличающееся от культур с анти-IL-1b-антителами, но по сравнению с контролем уровень захвата метки был так же достоверно ниже. Как видно рис. 10Б, у второй группы доноров на фоне анти-IL-1b-антител интенсивность пролиферативного ответа в присутствии b-эндорфина не изменяется.

А

 

 без ФГА ФГА 2,5 мкг/мл

Б

 

 без ФГА ФГА 2,5 мкг/мл

Рис. 11. Влияние b-эндорфина, DAGO, DADLE на продукцию IFN-g в нефракционированной (А) и фракционированной культурах (Б).

Здесь и на рис. 12 число наблюдений n=10. * - р<0,05 к контролю по парному t-критерию Стъюдента.

А

 

 без ФГА ФГА 2,5 мкг/мл

Б

 

 без ФГА ФГА 2,5 мкг/мл

Рис. 12. Влияние b-эндорфина, DAGO, DADLE на продукцию IL-4 в нефракционированной (А) и фракционированной клеточных культурах (Б).

* - р<0,05 к контролю по парному t-критерию Стъюдента.

При культивировании лейкоцитов в присутствии диклофенака натрия как стимулирующий, так и угнетающий эффект b-эндорфина на пролиферативный ответ нивелируется, что подтверждает данные о возможном участии простагландинов (простагландина E₂ (PGЕ₂), в частности) в регуляции функциональной активности лимфоцитов под воздействием опиоидных пептидов. Таким образом, регуляция функциональной активности лимфоцитов b-эндорфином может опосредоваться как системой IL-1, так и простагландинами.

Влияние β-эндорфина и селективных лигандов опиатных рецепторов на процессы клеточной кооперации и переключение Th1/Th2 цитокинового профиля. Следующим этапом исследований являлось изучение роли b-эндорфина в регуляции продукции IL-4 и IFN-g в супернатантах нефракционированной лейкоцитарной взвеси, лимфоцитарной фракции и культуре CD4+ клеток. Как показано на рис. 11, уровень g-IFN в супернатантах под воздействием b-эндорфина, а также в случае комбинации b-эндорфина с налоксоном не отличается от контроля как в нефракционированных культурах, так и в культурах, очищенных от моноцитов, независимо от присутствия ФГА в среде культивирования. Однако в фракционированных клеточных культурах, стимулированных митогеном, регистрируется эффект селективного d-агониста DADLE на продукцию IFN-g, что, очевидно, обусловлено его прямым эффектом на рецепторные структуры клеточной поверхности лимфоцитов.

На рис. 12 приведены результаты исследования влияния b-эндорфина, DAGO, DADLE на продукцию IL-4 в нефракционированной лейкацитарной суспензии и фракции лимфоцитов. По нашим данным, под воздействием налоксона и DAGO в культурах без митогена регистрируются угнетающий и стимулирующий эффекты соответственно. Выраженный стимулирующий эффект на ФГА-индуцированную продукцию IL-4 оказывают b-эндорфин, налоксон и DADLE. В очищенной фракции лимфоцитов значимых эффектов исследуемые соединения на продукцию IL-4 не выявляется, за исключением угнетающего эффекта

Рис 13. Влияние b-эндорфина 10^{-7 М на продукцию} IL-4 фракцией мононуклеаров, CD4⁺-лимфоцитами и CD4⁺-лимфоцитами в присутствии моноцитов в присутствии ФГА 2,5 мкг/мл.

* - р < 0,05; ** - р < 0,01; *** - р < 0,001 к контролю по парному t-критерию Стъюдента.

Рис 14. Влияние DADLE 10^{-7 М на продукцию} IL-4 фракцией мононуклеаров, CD4⁺-лимфоцитами и CD4⁺-лимфоцитами в присутствии моноцитов в присутствии ФГА 2,5 мкг/мл.

* - р < 0,05; ** - р < 0,01; *** - р < 0,001 к контролю по парному t-критерию Стъюдента.

налоксона, зарегистрированного в культурах без добавления митогена. Корреляционный анализ выявил отрицательную зависимость (r=-0,68; р<0,05) между интенсивностью пролиферации и уровнем IL-4 в культурах с совместным внесением b-эндорфина и налоксона в присутствии ФГА. Таким образом, b-эндорфин, налоксон и селективный агонист δ-рецепторов DADLE, усиливая пролиферацию, способствуют изменению соотношения Т-хелперов в сторону Th2-клеток.

Учитывая, что во фракции лимфоцитов находятся Т-, В-лимфоциты, NК-клетки, присутствие которых может оказывать влияние на конечный результат, дальнейшие эксперименты проводились с использованием CD4⁺-клеток, основных продуцентов IL-4. Как видно из рис. 13, b-эндорфин усиливает продукцию IL-4 во фракции мононуклеаров и не влиет на уровень IL-4в культуре CD4⁺-клеток. Добавление к CD4⁺-лимфоцитам моноцитов приводит к восстановлению уровня продукции IL-4 под воздействием b-эндорфина. Аналогичный по силе и направленности эффект на продукцию IL-4 CD4⁺-лимфоцитами оказывает селективный d-агонист DADLE (рис. 14). Анализ влияния m-агониста DAGO выявил тенденцию

Рис 15. Влияние DAGO 10^{-8 М на продукцию} IL-4 фракцией мононуклеаров, CD4⁺-лимфоцитами и CD4⁺-лимфоцитами в присутствии моноцитов в присутствии ФГА 2,5 мкг/мл.

* - р < 0,05; ** - р < 0,01; *** - р < 0,001 к контролю по парному t-критерию Стъюдента.

к усилению продукции IL-4 фракцией мононуклеаров (рис. 15), однако статистически достоверного эффекта достичь не удалось. Как видно из рис. 16, внесение b-эндорфина на ФГА-индуцированную продукцию IL-2 мононуклеарами, CD4⁺-лимфоцитами и комбинацией CD4⁺-лимфоциты+моноциты влияния не оказывает. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что от присутствия моноцитов зависит направленность влияния b-эндорфина и d-агониста DADLE на Th1/Th2-поляризацию лимфоцитов. Учитывая важное участие d-рецепторов в регуляции синтеза IL-4 была проанализирована их роль в эффекте b-эндорфина на продукцию данного цитокина. В условиях блокады d-рецепторов нивелируется усиливающее действие пептида на уровень IL-4 в нефракционированных клеточных культурах. Во фракции лимфоцитов b-эндорфин и налтриндол на продукцию IL-4 не влияют (рис. 17).

Таким образом, результаты проведённых исследований свидетельствуют о важной роли моноцитов в регуляции секреторной активности клеток адаптивного иммунитета, при этом как агонисты, так и антагонисты опиатных рецепторов оказывают самостоятельные эффекты на активность клеточных популяций.

Рис 16. Влияние b-эндорфина 10^{-7 М на продукцию} IL-2 фракцией мононуклеаров, CD4⁺-лимфоцитами и CD4⁺-лимфоцитами в присутствии моноцитов в присутствии ФГА 2,5 мкг/мл.

* - р < 0,05; ** - р < 0,01; *** - р < 0,001 к контролю по парному t-критерию Стъюдента.

А Б

Рис. 17. Эффекты b-эндорфина на фоне блокады d-опиатных рецепторов на продукцию IL-4 в нефракционированной клеточной взвеси (А) и фракции лимфоцитов (Б) в присутствии ФГА 2,5 мкг/мл.

* - р < 0,05; ** - р < 0,01; *** - р < 0,001 к контролю по парному t-критерию Стъюдента.

Роль b-эндорфина в регуляции фагоцитарной активности клеток естественного звена иммунитета. По нашим данным, β-эндорфин в концентрациях 10^-7 и 10^{-8 М (46,25}±1,57 в контроле – 51,3±1,66 - β-эндорфин 10^{-7 М;} P<0,001 к контролю) увеличивает процент фагоцитоза и фагоцитарное число нейтрофилов (0,61±0,02 в контроле - 0,68±0,03 β-эндорфин 10^{-7 М;} P<0,001 к контролю). Помимо нейтрофилов пептид усиливает фагоцитарную активность моноцитов в концентрациях 10^-7 – 10^{-8 М, увеличивая процент фагоцитоза (36,9}±2,75 в контроле – 47,7±4,8 - β-эндорфин 10^{-7 М;} P<0,05 к контролю) и фагоцитарное число (0,44±0,03 в контроле - 0,67±0,08 β-эндорфин 10^{-7 М;} P<0,05 к контролю). Так же b-эндорфин стимулирует общий (суммарный) фагоцитоз. На фагоцитарную активность эозинофилов β-эндорфин не влияет.

Роль b-эндорфина в регуляции цитокинпродуцирующей функции моноцитов и нейтрофилов. Как видно из табл. 5, 6, ЛПС усиливает продукцию IL-1b, TNF-a, IL-6 только в культурах с фракцией моноцитов, в то время как в культуре лейкоцитов эффект ЛПС на синтез IL-1b, TNF-a, IL-6 отсутствует. В тоже время уровень IL-8 в ответ на ЛПС усиливается в нефракционированной клеточной фракции и не изменяется в очищенной моноцитарной фракции. В нефракционированной клеточной культуре b-эндорфин (10^-7-10^-11М) активирует LPS-индуцированную продукцию IL-1b, не влияя на синтез IL-6, TNF-a и угнетая продукцию IL-8 в концентрациях 10^-7 и 10^-11М. b-эндорфин в концентрациях 10^-7 - 10^-11М усиливает продукцию IL-1ra, рецепторного антагониста IL-1b. Значительно менее выраженный стимулирующий эффект пептид оказывает на спонтанную продукцию IL-1b в концентрациях 10^-7 и 10^-9М. На индуцированную субоптимальной дозой ФГА продукцию исследуемых цитокинов, а так же на их спонтанный и ЛПС-индуцированный синтез в очищенной фракции моноцитов b-эндорфин не влияет.

Данные, представленные на рис. 18 указывают на отсутствие отмены стимулирующего эффекта b-эндорфина на уровень IL-1b в условиях блокады опиатных рецепторов неселективным антагонистом налоксоном (d, m) и селективным d-антагонистом налтриндолом в течение 24 ч культивирования. Также обнаруживается самостоятельный стимулирующий эффект налтриндола на продукцию IL-1b. Выявленная динамика сохраняется в течение 48 ч культивирования. Действие b-эндорфина на продукцию антагониста IL-1b IL-1ra (рис. 19) имело картину, схожую с полученной нами при анализе продукции IL-1b. b-эндорфин и налтриндол

Таблица 5. Влияние b-эндорфина на продукцию IL-1b, TNF-a, IL-6 в нефракционированной лейкоцитарной суспензии

Цитокин,	Экспериментальное	Концентрация b-эндорфина, M
пг/мл	воздействие	контроль	10-7	10-9	10-11
IL-1b,	Без индуктора	193,01±	271,66±	266,57±	238,22±
n=8		39,16	77,96*	49,18*	50,19
	ЛПС 0,1 мкг/мл	190,87±	305,76±	300,95±	279,41±
		54,43	49,50***	76,95**	62,40*
TNF-a,	Без индуктора	253,72±	286,79±	277,46±	290,90±
n=8		52,60	61,43	67,08	62,32
	ЛПС 0,1 мкг/мл	269,59±	297,93±	295,42±	295,49±
		53,90	66,45	68,59	60,45
IL-6,	Без индуктора	1115,41±	1084,09±	1101,83±	1109,70±
n=8		30,54	50,23	56,55	46,66
	ЛПС 0,1 мкг/мл	1094,73±	1082,85±	1051,07±	1115,41±
		36,40	28,72	36,16	33,88
IL-8,	Без индуктора	1353,68±	1340,28±	1664,63±	1313,30±
n=4		114,42	104,42	44,10	156,25
	ЛПС 0,1 мкг/мл	1699,20±	1278,40±	1635,43±	1364,28±
		68,25а	31,34***	68,31	59,85**
IL-1ra,	Без индуктора	1811,38±	1840±	1817,25±	1932,5±
n=4		272,30	275,54	431,75	297,55
	ЛПС 0,1 мкг/мл	1957,13±	2346,5±	2168,13±	2175,13±
		232,16	198,97***	261,74*	198,06*

Примечание. Здесь и в табл. 6: * - р < 0,05; ** - р < 0,01; *** - р < 0,001 к контролю по парному t-критерию Фишера наименьшей значимой разницы, a – р <0,05 – к спонтанной продукции.

стимулируют продукцию IL-1ra по сравнению с контролем как на 1-е, так и на 2-е сутки культивирования. Отмены стимулирующего влияния пептида на фоне блокады опиатных рецепторов не наблюдается. Анализ влияния пептида на продукцию IL-8 показал статистически достоверный угнетающий эффект как на 24, так и на 48 ч культивирования. В условиях блокады опиатных рецепторов налоксоном и налтриндолом угнетающее влияние b-эндорфина нивелируется. Внесение налоксона и налтриндола на продукцию IL-8 не влияет.

Таблица 6. Влияние b-эндорфина на продукцию IL-1b, TNF-a, IL-6 в очищенной фракции моноцитов

Цитокин,	Экспериментальное	Концентрация b-эндорфина, M
пг/мл	воздействие	контроль	10-7	10-9	10-11
	Без индуктора	153,22±	121,65±	249,92±	118,71±
IL-1b,		33,48	19,83	84,88	28,97
n=8	ЛПС 0,1 мкг/мл	230,26±	202,84±	223,97±	235,21±
		42,25а	36,47	71,16	53,29
	Без индуктора	137,52±	153,81±	148,31±	133,20±
TNF-a,		51,33	58,24	57,56	55,31
n=8	ЛПС 0,1 мкг/мл	163,21±	178,81±	174,97±	178,73±
		60,48а	69,78	68,63	70,21
	Без индуктора	1204,61±	1174,58±	1281,19±	1243,46±
IL-6,		354,15	356,34	357,40	332,03
n=8	ЛПС 0,1 мкг/мл	1435,55±	1442,89±	1346,26±	1414,19±
		379,02а	340,04	342,73	367,26
	Без индуктора	1198,38±	1230,63±	1294,63±	1148,68±
IL-8,		153,25	85,79	219,75	200,81
n=4	ЛПС 0,1 мкг/мл	1307,22±	1422,48±	1159,64±	1228,32±
		213,04	90,89	121,80	154,70
	Без индуктора	280,38±	364,25±	352,83±	359,05±
IL-1ra,		90,82	128,06	133,52	146,50
n=4	ЛПС 0,1 мкг/мл	302,13±	343,40±	377,35±	348,80±
		88,60	115,95	148,54	141,58

При оценке влияния опиатов на уровень TNF-a выявлено угнетение продукции TNF-a по сравнению с контролем при совместном внесение в культуры b-эндорфина и антагонистов опиатных рецепторов на 24 и 48 ч культивирования (см. рис. 18). На продукцию IL-6 на 24 ч культивирования b-эндорфин не влияет. На 48 ч культивирования продукцию IL-6 стимулирует налтриндол как при изолированном внесении, так и в комбинации с b-эндорфином. Учитывая, что во фракции лейкоцитов помимо моноцитов, основных продуцентов провоспалительных цитокинов, присутствуют гранулоциты, преимущественно нейтрофилы (Abraham et al., 2003; Fujiharaa et al., 2003; Xing, Remick, 2004), так же способные продуцировать IL-1b и IL-8, мы