3.2 Количественная регистрация интенсивности флуоресценции
По характеру нативного свечения в УФ-лучах можно с достаточной точностью диагностировать степень жизнеспособности клеток водорослей. Однако глазомерные оценки интенсивности свечения требуют выражения их в определённых и достаточно объективных количественных показателях. В связи с изменением спектра флуоресценции клеток водорослей при разных физиологических состояниях (см. выше) возникает необходимость разработки методов быстрой количественной регистрации интенсивности нативного свечения хлорофиллсодержащих клеток, как источника объективной информации о состоянии их жизненной активности.
Для количественного измерения интенсивности свечения может быть использована специальная установка, собранная из отдельных блоков - микроскопа МЛД-1, ФЭУ-22, источника питания Б5-24 (ВС-22), микрорентгенометра, автоматического потенциометра ЭПП-09.
Микроскопирование альгологических объектов проводится с помощью люминесцентного микроскопа МЛД-1, предназначенного для визуального наблюдения объектов в свете их люминесценции, возбуждаемой ультрафиолетовой областью спектра. Принцип работы прибора основан на использовании явления люминесценции объектов, возникающей под действием лучей определённого спектрального состава.
Объекты освещают сверху через опак-иллюминатор и объектив по методу светового поля. Возбуждение люминесценции через объектив, т.е. с той же стороны, что и её регистрация, позволяет в значительной мере уменьшить ошибки, связанные с реабсорбцией люминесценции.
Интенсивность свечения образцов регистрируется с помощью фотоэлектронного умножителя ФЭУ-22, присоединённого к микроскопу через имеющееся в верхней части головки отверстие для фотографирования. ФЭУ питается от стабилизированного источника питания. Регистрация сигналов с ФЭУ осуществляется усилителем постоянного тока с помощью микрорентгенометра и последующей фиксацией на ленте автоматического потенциометра ЭПП-09. Для интенсивности флуоресценции отражающее зеркало откидывают с помощью рукоятки. При этом направляют световой поток на ФЭУ, а величину фототока регистрируют микрорентгенометром.
Величину участка флуоресцирующего препарата регулируют с помощью диафрагм, имеющихся в оптической схеме микроскопа. Используя числовые показатели, можно снимать интенсивность флуоресценции строго с определённого по величине участка. Последний может быть представлен целым трихомом, колонией, пучком трихомов или единичной клеткой.
Особое значение имеет техника приготовления препарата. Для плотных суспензий водорослей с размерами клеток более 10 µ микроскопируют каплю исследуемого образца. Её наносят на предметное стекло, прикрывают покровным и микроскопируют. При исследовании неплотных суспензий с размерами клеток в пределах 4-7 µ отдельную клетку можно выделить только при использовании иммерсионной системы и объективов с увеличением 60-90 и более раз. Поэтому необходимо провести предварительное сгущение образца. Это делают либо путём центрифугирования – микроскопируют осадок, либо после фильтрования определённого объёма суспензии (1-10 мл) через мембранный фильтр. Настройку и чёткость видимости деталей препарата осуществляют с помощью макро- и микровинтов при отсутствии сигнала на ФЭУ. Величина фототока пропорциональна интенсивности свечения и с достаточной чувствительностью регистрируется микрорентгенометром.
Смонтированная по указанной блок-схеме установка даёт возможность не только измерять интенсивность участков препарата и получать количественные характеристики флуоресценции, отвечающие определённым жизненным состояниям клеток водорослей, но и снимать временную характеристику изменения интенсивности свечения, которая позволяет судить о состоянии хлорофилл-белково-липоидного комплекса. [13]
3.3 Оценка степени токсичности отдельных веществ для водорослей
Методы люминесцентного анализа и измерения флуоресценции хлорофилла были применены для оценки степени токсичности отдельных веществ для водорослей, макрофитов, фитообрастаний в лабораторных, полевых и экспедиционных условиях, на модельных экосистемах, а так же для оценки токсичности сточных вод и загрязнения природных водоёмов.
С помощью этого метода можно провести тестирование на культурах водорослей различных веществ: пропанида, смеси сатурна и пропанида, метафоса, смеси фенола и формальдегида. Измерение флуоресценции хлорофилла показывает быструю реакцию фотосинтетического аппарата клеток различных видов водорослей на внесение веществ (самыми токсичными являются пропанид, метафос, смесь пропанида и сатурна). Результаты люминесцентного микроскопирования показывают, что глубокого изменения в клетках водорослей Chlorella vulgaris и Scenedesmus quadricauda внесение токсикантов не вызывает. Более чувствительна к данным веществам морская жёлто-зелёная водоросль Phaeodactilum trucornutum наблюдается лизис мёртвых клеток в присутствии пропанида и значительное (в 7 раз) снижение численности клеток после внесения в культуру метафоса.
Эксперименты, проведённые в данном направлении, позволяют предположить, что если в водоёмы будут постоянно поступать загрязняющие вещества в невысоких концентрациях, то при благоприятных температурных условиях и достаточном количестве питательных веществ могут развиваться сине-зелёные водоросли, клетки которых имеют защитный слой слизи, через которую поступление токсического вещества затруднено, а продукция ценных в кормовом отношении водорослей будет подавлена. Такие изменения в дальнейшем могут привести к перестройке биоценоза: водоём из ценного рыбохозяйственного может превратиться в малоценный с измененным составом воды. [15]
0 комментариев