3. Получение полиэлектролитных микрокапсул
Капсулы получали на CaCO3 частицах с диаметром 3-5 мкм последовательной адсорбцией Alg (2 мг/мл) и PLL (2 мг/мл) в 0,02 N NaCl. Нанесение каждого слоя полиэлектролитов проводили в течение 15 минут, затем частицы центрифугировали и дважды промывали в 0,02 N NaCl. При агрегации частиц между собой в процессе адсорбции ПЭ, суспензию микрочастиц подвергали обработке ультразвуком (максимальная мощность) в течение 1-3 сек. После нанесения 3-ех слоев Alg и 3–ех слоев PLL, CaCO3- частицы растворяли 0,2М раствором ЭДТА, рН 7,0. После полного растворение карбонатной матрицы, микросферы промывали в воде 3 раза (время инкубации 3-5 минут) и хранили в виде суспензии при 4 оС.
4. Определение содержания белка в микрочастицах и растворах
Определения концентрации белка в растворах проводили спектрофотометрически. Для этого в кювету на 1,5 мл вводили 1 мл раствора белка и измеряли оптическую плотность при 280 нм. Исследуемые растворы были разбавлены, с учетом коэффициента экстинкции для каждого белка, таким образом, чтобы значение оптической плотности не превышало 2. Калибровочную кривую строили с использованием того же белка, который использовали для получения микрочастиц. Эффективность включения (иммобилизации) белка определяли как отношение оптической плотности в исходном растворе (Dисх) к значению в супернатанте после сорбции(Dсорб).
5. Измерение протеолитической активности ХТР
Для изучения протеолитической активности иммобилизованного ХТР в водной среде (0,08 М ТРИС-буфер, рН 7,8, содержащий 0,1М CaCl2), использовали следующую методику. 40 мкл раствора ХТР или суспензии микросфер с ХТР добавляли в кювету на 1,5 мл, содержащую 0,15 мл 0,08 М ТРИС-буфера, рН 7,8 и 0,14 мл 0,00107 М BTEE в 50% растворе метанола (63 мл абсолютного метанола в 50 мл воды). Прирост оптической плотности регистрировали спектрофотометрически при длине волны 256 нм в течение 5 минут. При этом каждую минуту кювету встряхивали, чтобы избежать осаждения микросфер с включенным белком. Таким образом, прирост оптической плотности был обусловлен накоплением продукта ферментативного гидролиза.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ1. Получение микрокапсул с ХТР на основе CaCO3-частиц
Полиэлектролитные микрокапсулы были получены ступенчатой адсорбцией [5] противоположно заряженных Alg и PLL на твердых CaCO3-частицах. Впервые микрочастицы из карбоната кальция были получены и применены в качестве деградируемой матрицы для получения ПЭ микрочастиц в работе [10]. Непосредственное взаимодействие эквимолярных растворов карбоната натрия и хлорида кальция при перемешивании приводит к кристаллизации малорастворимой соли CaCO3. Образующиеся в результате микрочастицы имеют сферическую форму и размер несколько микрон (микрометров?). Микрофотографии таких частиц, полученные с помощью сканирующего электронного микроскопа, представлены на рисунке 1. На фотографии можно видеть внутреннюю канало-подобную структуру частиц. Формирование такого рода архитектуры вызвано специфическим процессом роста частиц [21].
Для получения микросфер (Alg/PLL)3, в качестве агента для растворения CaCO3 матрицы, была использована ЭДТА (рН 7,0). Использование CaCO3 частиц позволяет проводить процесс микрокапсулирования в физиологически оптимальных значениях рН, что особенно важно для иммобилизации БАВ, в частности – белков. Первым ПЭ наносился Alg в силу отрицательного заряда CaCO3 микрочастиц (ξ-потенциал поверхности составил –12,2±2,5 мВ). В процессе последовательной адсорбции макромолекулы ПЭ проникают в поры CaCO3 микрочастиц, так как размер пор (30-90 нм) в несколько раз больше размера макромолекул ПЭ. Таким образом, во внутренних каналах микрочастиц происходит формирование интерполиэлектролитного комплекса. После растворения CaCO3 матрицы ПЭ комплекс остается стабильным [21].
Размер микросфер в растворе соответствовал размеру исходной матрицы - CaCO3 микрочастиц. Данный факт подтверждается наблюдениями за микрочастицами в процессе удаления карбонатной матрицы (оптическая микроскопия). На рисунке 2 представлены фотографии CaCO3 микрочастиц (А) и ПЭ микросфер, полученных на их основе (Б). Сохранение микросферами формы и размера, использованных для их получения матриц, говорит о придании полиэлектролитным «каркасом» существенной прочности ПЭ микросферам, в том числе по отношению к осмотическому давлению, возникающему при растворении твердой CaCO3 матрицы. Это особенно ценно, так как «осмотический шок» при растворении матрицы, покрытой оболочкой из ПЭ комплекса, вызывает увеличение размера образующихся микросфер, состоящих из ПЭ оболочки, или даже деформацию и разрушение таких ПЭ микрокапсул [22].
Известно, что адсорбция белков из раствора на твердой поверхности является результатом нескольких основных процессов [23]: а) электростатического взаимодействия между белком и поверхностью; б) взаимодействия между молекулами белков; в) изменения структуры белка. Таким образом, контакт белка с твердой поверхностью определяется как межмолекулярными, так и внутримолекулярными силами.
В процессе получения микрокапсул наносилось по 3 слоя каждого ПЭ, исходная концентрация ХТР составляла 5 мг/мл и 10 мг/мл. Анализ полученных результатов показал, что процент сорбции на 100 мг частиц при начальной концентрации 5 мг/мл составил 80% (4 мг/мл ХТР), 10 мг/мл – 41% (4,1 мг/мл ХТР). ? Включение ХТР в CaCO3 микрочастицы проводили методом адсорбции в порах (АП). О равномерном распределении фермента ....
0 комментариев