Методы диагностики и профилактики микробной контаминации при трансплантации эмбрионов

Содержание

Введение 1. Обзор литературы 1.1 Состояние и перспективы применения метода трансплантации эмбрионов 1.2 Чувствительность матки к инфекциям в разные периоды полового цикла 1.3 Предупреждение заноса инфекции в матку при извлечении и пересадке эмбрионов 1.4 Влияние микроорганизмов на спермии, яйцеклетки и эмбрионы 1.5 Влияние антибиотиков на спермии, яйцеклетки, эмбрионы 2. Собственные исследования 2.1 Цель и задачи 2.2 Материалы и методика исследований 2.2.1 Подготовка лаборатории, посуды и инструментов для манипулирования с эмбрионами 2.2.2 Подготовка доноров и реципиентов 2.2.3 Извлечение и подготовка эмбрионов к пересадке 2.2.4 Влияние микробного фактора на приживляемость эмбрионов 2.3 Анализ экономической деятельности предприятия 2.4 Характеристика предприятия 2.5 Результаты исследований 2.5.1 Разработка мер предупреждения микробной контаминации эмбрионов на технологических этапах их подготовки 2.5.2 Экономическая эффективность ветеринарных мероприятий 2.6 Обсуждение результатов собственных исследований 3. Охрана труда 3.1 Организация охраны труда 3.2 Производственная санитария 3.3 Пожарная безопасность Выводы и предложения Выводы Предложения производству Список литературы

Введение

Современные темпы развития животноводства требуют совершенствования существующих методов селекционной работы с целью создания и ускоренного размножения высокопродуктивных животных (А.П. Студенцов и др. 2000). Более интенсивное использование репродуктивного потенциала ценных в племенном отношении женских особей возможно при трансплантации эмбрионов.

Одним из главных условий успешного применения метода трансплантации эмбрионов в животноводстве является асептичность проводимых операций (A. Brand et al., 1978; H. Kupferschmid; 1984 E. Singh, 1985; А. Овчинников, 1985; Ф.И. Осташко и соавт., 1986).

В технологии трансплантации эмбрионов важное место отводится разработке методов, предупреждающих возможность контаминации их патогенной микрофлорой, которые обеспечивают получение здоровых телят и профилактируют появление гинекологических болезней, в частности, эндометритов как у коров – доноров, так и у реципиентов.

При манипулировании с эмбрионами вне организма нельзя допускать их инфицирования и переноса микроорганизмов в матку реципиента (M. Tibier, 1985; I. Atwell, 1987). Бактериальному загрязнению эмбрионы подвергнуты и при их оценке. Многие авторы утверждают, что как яйцеклетка, так и эмбрион с интактной зоной пеллюцида надежно защищены от микробного фактора, тем не менее, некоторые из них рекомендуют многократное отмывание эмбрионов в стерильных буферных средах или в средах с добавлением ферментов (R.A. Bowen et al., 1983; E. Singh et al., 1982; 1983; W. Hare et al., 1984). Именно поэтому руководством международного общества по пересадке эмбрионов (Manual of the international embryo transfer, 1986) предусмотрен санитарный контроль их качества.

В нашей стране и за рубежом ведутся интенсивные работы по разработке оптимальных способов трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота. Продолжаются исследования по совершенствованию гигиенических и технических приемов получения и пересадки эмбрионов.

Анализ литературных данных показал целесообразность исследований по совершенствованию гигиенических приемов при трансплантации эмбрионов. Это продиктовано недостаточным количеством противоречивых данных о влиянии микроорганизмов на приживлямость эмбрионов. Существует мнение, что внесение инфекции в матку с пистолетом Кассу не является причиной яловости, если в остальном соблюдена асептика (A. Brand, 1976; A. Trounson, 1978). Однако, в качестве дополнительной предосторожности от возможности внесения влагалищной инфекции в матку реципиента кембриджские сотрудники покрывали наконечник пистолета пластиковым чехлом. Другие исследования А. Бранда показали, что даже в случае отрицательной бактериологической пробы инструмента после нехирургической трансплантации эмбрионов может произойти вирусное заражение в ходе ее осуществления (A. Brand, 1978). Оно может быть причиной последующих осложнений, в частности, эндометритов. А у коров-доноров, больных эндометритом, наблюдали частичную или полную дегенерацию эмбрионов на разных стадиях их развития, при значительном числе неоплодотворенных яйцеклеток (А.Д. Бугров и соавт., 1988). Поэтому стало необходимым более детально изучить вопросы бактериальной контаминации половых путей коров и телок при манипуляциях извлечения и пересадки эмбрионов, влияние ее на их приживляемость, с одной стороны, и найти эффективные антимикробные средства, с другой стороны.

Целью нашей работы была разработка методов профилактики и санитарного контроля технологических процессов при трансплантации эмбрионов у крупного рогатого скота.

Для достижения этой цели нами поставлены на разрешение следующие задачи:

1. Изучить бактериальную контаминацию половых путей телок-реципиентов в фолликулярную и лютеальную фазы полового цикла.

2. Изучить влияние антибактериальных препаратов на микрофлору половых путей после их санации непосредственно перед извлечением и пересадкой эмбрионов.

3. Провести сравнительную оценку антибактериальных препаратов для санации половых путей.

4. Испытать антибиотики для санации промывных буферных сред и отмывки эмбрионов.

5. Изучить влияние испытанных нами антибактериальных препаратов на жизнеспособность и приживляемость эмбрионов.

1. Обзор литературы

  1.1 Состояние и перспективы применения метода трансплантации эмбрионов

Трансплантация эмбрионов женским особям сравнима по возможностям с техникой искусственного осеменения, позволяющей полнее использовать генотип выдающихся самцов. Однако широкое внедрение этой перспективной технологии сдерживается несовершенством методов получения большого числа зрелых, полноценных, способных к оплодотворению ооцитов (Y. Koinig., 1980), а также сравнительно высокой трудоемкостью и стоимостью работ (В.В. Мадисон, В.Л. Мадисон, 1988).

В странах СНГ работы по трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота начаты в 1975 г. Первые телята были получены в начале 1977 г. (М.И. Прокофьев и соавт., 1977) во Всесоюзном НИИ физиологии, биохимии и питания сельскохозяйственных животных, а первый теленок от пересадки замороженного эмбриона во Всесоюзном институте животноводства в 1980 г. С 1983 года организованы четыре центра трансплантации эмбрионов: ВИЖ, ВНИИРГЖ, НИИЖ Лесостепи и Полесья. УССР, Украинский НИИ разведения и искусственного, осеменения крупного рогатого скота (Н.З. Жильцов, В.В. Мадисон и соавт., 1986). Мировая практика пересадки эмбрионов успешно развивается. Применение метода трансплантации эмбрионов непрерывно растет. При этом технология технически совершенствуется, а эффективность метода возрастает (Ф.И. Осташко, 1995; Т.И. Шкиль, 1995; Ф.С. Мауссе, 1999; М.Л. Дибиров, 2000).

В настоящее время наиболее эффективен нехирургический метод трансплантации эмбрионов. В среднем на современном уровне биотехнологи получают с применением пересадки эмбрионов около 10 телят, а в отдельных случаях до 50 телят от одного донора в год, тогда как при обычном способе размножения (искусственном осеменении) корова за всю жизнь могла бы воспроизвести 7–8 телят. Поэтому идея получения максимального числа потомков от лучших по продуктивности самок издавна привлекала внимание исследователей. Решение этой проблемы стало возможным на основе применения метода трансплантации эмбрионов (Ю.Д. Клинский, 1978, 1980; Н.И. Сергеев, 1979,1984; М.И. Прокофьев, 1983).

В последние годы в ряде стран изучают вопрос о возможности переноса заразных болезней путем эмбриональной пересадки реципиентам от коров-доноров. Ряд зарубежных авторов считают, что методом трансплантации эмбрионов можно успешно вести борьбу со многими инфекционными болезнями. По некоторым опубликованным данным отдельные инфекции, например, инфекционный ринотрахеит, вирусная диарея, блутанг, лейкемия крупного рогатого скота реципиентам с трансплантируемым зародышем от больного донора не передаются (R.A. Bowen et al., 1983; Е. Singh et al., 1983; Z. Pokorny et al., 1983; L. Elizabeth, 1984).

По данным французских исследователей, вирус лейкоза крупного рогатого скота и вирус катаральной лихорадки при эмбриотрансплантации не передаются через эмбрионы с интактной зоной пеллюцида, если их до пересадки промыть раствором трипсина (W.C. Наге, 1984).

Несмотря на достигнутые успехи в разработке приемов вызывания множественной овуляции у коров и телок-доноров эмбрионов, технике извлечения и пересадке зародышей, выход полноценных эмбрионов и их приживляемость не стабильна.

Многие вопросы теории и практики требуют дальнейшего изучения и совершенствования.

Проблемными остаются вопросы предупреждения заноса инфекции в матку при извлечении и пересадке эмбрионов.

3.2 Чувствительность матки к инфекциям в разные периоды полового цикла

Здоровый организм млекопитающих имеет целую систему защитных приспособлений, поэтому деятельность микроорганизмов-сапрофитов ограничивается и не является болезнетворной. В норме эта микрофлора отсутствует в глубоких отделах полового тракта самки, сообщающегося с брюшной полостью (В.П. Буркат, Г.Г. Харута та ін. 1995; Н.А. Мартыненко, 1971; Е.В. Козловский, П.А. Емельяненко, 1982), хотя во влагалище, помимо постоянно заселяющих его молочнокислых палочек, находят различные виды кокков и другие бактерии. Многочисленными исследованиями установлено, что в половых путях коров с нормальной и нарушенной воспроизводительной функцией часто присутствуют штаммы условно-патогенной микрофлоры: E.coli, Klebsiella, Serritia, Proteus, Pseudomonas (Е.М. Махиня, 1958; D.S. Sambijal et al., 1986; Д.А. Сайкиа и соавт., 1987), но у большинства животных во время течки и охоты микрофлора погибает и смывы, полученные со слизистой оболочки влагалища коров, свободны от микроорганизмов (А.А. Осетров и соавт., 1966). С другой стороны, условнопатогенная микрофлора часто попадает в половые пути самок со спермой производителей, используемой при искусственном осеменении (С.Л. Семенов, 1955; О.И. Пантюхова, 1961; В.А. Яблонский, 1963; Ф.М. Касумов, 1963; Д.Д. Логвинов, 1968).

Многие ученые занимались изучением микробной загрязненности спермы производителей (Качмар О.М.; Авдосьева I.К.; Урус Р.В.), применяемой для искусственного осеменения самок, на их репродуктивную функцию. Большинство из них признают отрицательное действие микробов, попадающих в половые пути коров и телок при искусственном осеменении, на их воспроизводительную деятельность. В.К. Милованов (1964) утверждает, что причиной эмбриональной смертности является неспецифическая микрофлора, попадающая в матку со спермой. Д.Д. Логвинов (1972) считает, что прямой причиной снижения качества и оплодотворяющей способности спермы, частых абортов, массовых задержаний последа, эндометритов, бесплодия, эмбриональной смертности и понижения жизнеспособности новорожденных является обильное микробное загрязнение спермы производителей, применяемой для искусственного осеменения самок. Д. Логвинов, В. Плугатырев, В. Кошевой (1972) в 47,9% случаев выделили различные бактерии из околоплодных вод искусственно осемененных коров и в 6% случаев выделили различные бактерии из околоплодных вод естественно осемененных нетелей.

Бактериологический метод выделения кампилобактерий из спермы производителей трудоемок, длителен и неэффективен из-за частой контаминации спермы посторонней микрофлорой. Отсутствие антител в сперме животных не всегда позволяет сделать заключение о том, что сперма свободна от возбудителей кампилобактериоза (Родина В.Н., Бондаренко В.З.; Козло В.Н.; Скляров О.Д.; Советкин С.В.).

Другие авторы отмечают отсутствие отрицательного влияния естественной контаминации половых путей условно патогенной микрофлорой на воспроизводительную функцию коров и связывают это с тем, что: