2.2.5 Приготовление окрашенных препаратов
Обработка предметного стекла. Прежде чем приступить к приготовлению микроскопических препаратов необходимо предметные и покровные стекла, Они должны быть чистыми и обезжиренными. Доказательства хорошего обезжиривания является равномерное распределение капли воды на их поверхности (Асонов 1989).
Приготовление мазка. Мазок готовят на предметном стекле при помощи микробиологической петли или пастеровской пипетки. Мазки готовят из культур микробов, выращенных на плотных или жидких питательных средах. Петлю нагревают до покраснения. Над пламенем горелки открывают пробирку, внутрь ее вводят петлю. Охлаждают, после чего петлей соприкасаются с культурой, которую затем тонким слоем наносят на поверхность предметного стекла. При изготовлении мазков из плотных субстратов или агаровых культур на поверхность стекла вначале наносят каплю стерильной воды. Мазок фиксируют над пламенем горелки (Асонов 1989).
2.2.6 Техника окраски по Граму
На хорошо обезжиренное стекло наносят три тонких мазка разных культур микроорганизмов. Мазки высушивают на воздухе, фиксируют над пламенем горелки и окрашивают в течение 1 мин метилвиолетом. Сливают краситель и, не промывая препарат водой, наносят на него раствор Люголя на 1 мин (до полного почернения мазка). Препарат, на промывая водой, обрабатывают,96%-ным спиртом в течение 15-20 с. Время обесцвечивания очень существенно, при превышении указанного срока обесцвечивается и грамположительные клетки, при недостаточным сроке обработки препарат окажется перекрашенным. Промыв препарат водой, его окрашивают фуксином в течение 1 мин (Теппер 1987).
После этой обработки грамположительные микроорганизмы окрашиваются в темно-фиолетовый цвет, грамотрицательные имеют только цвет дополнительной окраски (фуксина).
Результаты окраски по Граму зависят от возраста культуры: в старых культурах клетки всегда окрашиваются грамотрицательно. Поэтому лучше использовать молодые односуточные культуры (Теппер 1987).
Определение бактерий группы кишечных палочек
При исследовании почв на присутствие БГКП рекомендуется применение титрационного метода при предполагаемой невысокой степени фекального загрязнения, метод мембранных фильтров используется при анализе малозагрязненных почв. При высокой степени фекального загрязнения рекомендуется делать прямой посев почвенной суспензии (1: 10) на среду Эндо.
Титрационный метод. Из приготовленных разведений почвенной суспензии делают посевы во флаконы и пробирки с жидкой питательной средой Кесслера – 10 мл (из разведения 1:10) – в 50 мл среды, по 1 мл из последующих разведений – в 9 мл среды. Посевы инкубируются в течение 48 ч при температуре 370С. При отсутствии во флаконах и пробирках роста, характеризующегося газообразованием и помутнением, дается отрицательный ответ об отсутствии БГКП.
Если в засеянных сосудах обнаруживается рост в виде помутнения среды или помутнения и газообразования, следует сделать высев в чашки Петри со средой Эндо или в пробирки с розолововым агаром, инкубировать 24 ч при температуре 37 0С . Дальнейшей идентификацией (аналогично определению БГКП в воде) подвергаются типичные для эшерихий красные или розовые с металлическим блеском колонии на среде Эндо, а также желтые или оранжевые колонии на розоловой среде. Результат выражается в коли – индексе, т. Е. количество БГКП, обнаруженных в 1 г почвы.
Глава 3 Результаты исследования
В ходе работы было проведено микробиологическое исследование образцов грунта пещеры Баскунчакская. Для выделения бактерий, дрожжей и грибов, представляющих естественную микрофлору пещеры, использовались среда МПА, Чапека и Сабуро. Учет численности проводился через 48 часов на МПА и через неделю на Чапеке и Сабуро. Для учета санитарно – показательных микроорганизмов (бактерий группы кишечная палочка) использовался бродильный метод. Посев осуществлялся со среды Кесслера на среду Эндо, учет результатов проводился через 2 суток культивирования при температуре + 37 0С. Учитывались окрашенные в красный цвет колонии, состоящие из грамотрицательных, оксидазоотрицательных палочек.
Таблица №1
Численность сапротрофной микрофлоры в пещере Баскунчакская.
| Проба | численность | Культуральные признаки колонии | Морфологические признаки | Предполагаемое название рода | ||
| Горизонтальный шкуродер | 7,5∙107 | Форма колонии амебовидная, профиль колонии: бугристый, край волнистый, поверхность: шероховатая. Размер колонии средний, оптические свойства: не прозрачная. Цвет: белый, структура колонии: однородная, консистенция: сухая | Споровые палочки Г «+» | Bacillus | ||
| Форма колонии амебовидная, профиль колонии: бугристый, край волнистый, поверхность: шероховатая. Размер колонии средний, оптические свойства: не прозрачная. Цвет: белый, структура колонии: однородная, консистенция: сухая | Споровые палочки Г «+» | Bacillus | ||||
| Форма колонии амебовидная, профиль колонии: бугристый, край волнистый, поверхность: шероховатая. Размер колонии средний, оптические свойства: не прозрачная. Цвет: белый, структура колонии: однородная, консистенция: сухая | Споровые палочки Г «+» | Bacillus | ||||
| Форма колонии амебовидная, профиль колонии бугристый, край колонии волнистый, поверхность гладкая. Размер крупный, оптические свойства блестящая. Цвет бежевый, структура колонии однородная Консистенция слизистая. | Споровые палочки Г «+» | Bacillus | ||||
| Форма колонии амебовидная, профиль колонии бугристый, край колонии волнистый, поверхность гладкая. Размер крупный, оптические свойства блестящая. Цвет бежевый, структура колонии однородная Консистенция слизистая. | Споровые Палочки Г «+», | Bacillus | ||||
| Галерея входа № 2 | 9,1∙106 | Форма колонии круглая с валиком, профиль колонии изогнутый, край колонии волнистый, поверхность шероховатая. Размер средний, оптические свойства не прозрачная. Цвет белый, структура колонии однородная, консистенция сухая. | Споровые палочки, Г «+» | Bacillus | ||
| Форма колонии амебовидная, профиль колонии изогнутый, край колонии волнистый, поверхность шероховатая, размер средний, оптические свойства не прозрачная. Цвет серый, структура колонии однородная, консистенция сухая | Споровые Палочки Г «+», | Bacillus | ||||
| Форма колонии амебовидная, профиль колонии: бугристый, край волнистый, поверхность: шероховатая. Размер колонии средний, оптические свойства: не прозрачная. Цвет: белый, структура колонии: однородная, консистенция: сухая | Споровые палочки Г «+» | Bacillus | ||||
| Проба | численность | Культуральные признаки колонии | Морфологические признаки | Предполагаемое название рода | ||
| Форма колонии амебовидная, профиль колонии изогнутый, край колонии волнистый, поверхность шероховатая, размер крупная, оптические свойства не прозрачная. Цвет грязно белый, структура колонии однородная, консистенция сухая | Споровые палочки Г «+» | Bacillus | ||||
| Форма колонии не правильная, профиль колонии изогнутый, край колонии волнистый, поверхность гладкая, размер средний, оптические свойства блестящая. Цвет бежевый, структура колонии однородная, консистенция слизистая. | Палочки со спорами Г «+» | Bacillus | ||||
| Галерея входа № 3 | 7,05 ∙106 | Форма колонии амебовидная, профиль колонии изогнутый, край колонии волнистый, поверхность шероховатая, размер средний, оптические свойства не прозрачная. Цвет серый, структура колонии однородная, консистенция сухая | Споровые палочки Г «+», споры | Bacillus | ||
| Форма колонии сложная, профиль колонии бугристый, край колонии волнистый, поверхность шероховатая. Размер средний, оптические свойства не прозрачная. Цвет оранжевый, структура колонии однородная, консистенция сухая. | Споровые палочки Г «+» | Bacillus | ||||
| Форма колонии амебовидная, профиль колонии бугристый, край колонии волнистый, поверхность гладкая. Размер крупный, оптические свойства блестящая. Цвет бежевый, структура колонии однородная, консистенция слизистая. | Споровые палочки Г «+» | Bacillus | ||||
| Форма колонии амебовидная, профиль колонии изогнутый, край колонии волнистый, поверхность шероховатая, размер крупная, оптические свойства не прозрачная. Цвет грязно белый, структура колонии однородная, консистенция сухая | Споровые палочки Г «+» | Bacillus | ||||
| Главная Галерея | 5,2 ∙106 | Форма колонии амебовидная, профиль колонии изогнутый, край колонии волнистый, поверхность шероховатая, размер крупная, оптические свойства матовая. Цвет бежевый, структура колонии однородная, консистенция сухая | Споровые палочки Г «+» | Bacillus | ||
| Вертикальный шкуро-дер | 1,7 ∙106 | Форма колонии амебовидная, профиль колонии изогнутый, край колонии волнистый, поверхность шероховатая, размер крупная, оптические свойства не прозрачная. Цвет грязно белый, структура колонии однородная, консистенция слизистая. | Споровые палочки Г «+» | Bacillus | ||
| Форма колонии амебовидная, профиль колонии изогнутый, край колонии волнистый, поверхность: гладкая, размер крупная, оптические свойства не прозрачная. Цвет белая, структура колонии однородная, консистенция сухая. | Споровые палочки Г «+» | Bacillus | ||||
| Лабиринт | 1,05 ∙106 | Форма колонии амебовидная, профиль колонии изогнутый, край колонии волнистый, поверхность гладкая, размер крупная, оптические свойства блестящая. Цвет бежевый, структура колонии однородная, консистенция слизистая. | Споровые палочки Г «+» | Bacillus | ||
| Форма колонии круглая, профиль колонии выпуклый, край колонии: гладкий, поверхность гладкая. Размер средний, оптические свойства блестящая. Цвет бежевый, структура колонии однородная, консистенция слизистая. | Споровые палочки Г «+» | Bacillus | ||||
| Форма колонии амебовидная, профиль колонии изогнутый, край колонии волнистый, поверхность гладкая. Размер крупная, оптические свойства не прозрачная. Цвет бежевый, структура колонии однородная, консистенция сухая. | Споровые палочки Г «+» | Bacillus | ||||
В шести исследуемых пробах грунта, в числе гетеротрофов, доминируют бациллы. Предположительно, основываясь на культуральных и морфологических признаках, обнаруженные микроорганизмы можно отнести к следующим родам: Bac.megaterium, Bac.subtiles, Bac.mesentericus.
Общее микробное число, варьирует от 7,5∙ 107 до 1,05 ∙ 106 кое/г.
При определении численности плесневых грибов был произведен начальный визуальный осмотр пещеры, на местах стоянок туристов, на грунте, были обнаружены колонии грибов. Микроскопирование показало, что данные колонии предположительно относятся к роду Penicillium.
На среде Чапека и Сабуро был осуществлен посев 6 проб грунта пещеры отобранных с учетом отдаленности от главных выходов и в трудно доступных местах.
Таблица № 2.
Численность грибов обнаруженных в пещере Баскунчакская.
| Проба | Численность кое/гм | Культуральные признаки колонии | Предполагаемое название рода |
| Главная Галлерея | 1,9 ∙ 105 | Консистенция шероховатая, край колонии желто-зеленый, обратная сторона: коричнева. Размер: 10-15мм, конидиальная зона: св. зеленая, экссудат: отсутствует. | Aspergillus |
| Консистенция шероховатая, край колонии желто-зеленый, обратная сторона коричнева, размер 10-15мм, конидиальная зона св. зеленая, экссудат отсутствует | Aspergillus | ||
| Вертикальный шкуродер | 1,5∙ 105 | Консистенция: хлопьевидная, край колонии: темно розовый, обратная сторона: пурпурная. Размер: 15-20мм, конидиальная зона: розовая, экссудат: отсутствует. | Fusarium |
| Лабиринт | 7,8∙ 105 | Консистенция: хлопьевидная, край колонии: бело - розовый, обратная сторона: пурпурная. Размер: 15-20мм, конидиальная зона: розовая, экссудат отсутствует. | Fusarium oxysporum |
| Консистенция: шероховатая, край колонии: св. коричневый, обратная сторона: св. коричневая. Размер: 40 мм, конидиальная зона: темно-зеленная, экссудат: отсутствует. | Penicillium | ||
| Консистенция: шероховатая, край колонии: св. коричневый, обратная сторона: св. коричневая. Размер: 40мм, конидиальная зона: темно-зеленная, экссудат: отсутствует. | Penicillium | ||
| Галерея входа № 2 | 1,7 ∙ 105 | Консистенция: шерховатая, край колонии: св. коричневый, обратная сторона: св. коричневая. Размер: 40мм, конидиальная зона: темно-зеленная, экссудат: отсутствует. | Penicillium
|
| Грязевой Сифон | 3,6∙ 105 | Консистенция ватная (хлопьевидная), край колонии: белый, обратная сторона: белая. Размер: 5 – 6 мм, конидиальная зона: белая, экссудат: прозрачный. | Acremonium.
|
| Консистенция: шероховатая, край колонии: оранжевый, обратная сторона: оранжевая. Размер: 15 – 20 мм, конидиальная зона: черная, экссудат: отсутствует | Aspergillus | ||
| Консистенция: ватная (хлопьевидная), край колонии: белый, обратная: св. коричневая. Размер: 15 – 20 мм, конидиальная зона: белая, экссудат: отсутствует. | Penicillium | ||
| Консистенция: зернистая, край колонии: серый, обратная: св. коричневая. Размер: 30 мм, конидиальная зона: белая, экссудат: отсутствует. | Penicillium | ||
| Консистенция: хлопьевидная, край колонии: бело - розовый, обратная сторона: пурпурная. Размер: 10 – 15 мм, конидиальная зона: желтая, экссудат: отсутствует. | Fusarium.
| ||
| В районе горизонтального шкуродера | 2,7∙ 105 | Консистенция: хлопьевидная, край колонии: белый, обратная сторона: св. коричневая. Размер: 15-20мм, конидиальная зона: белая, экссудат: отсутствует. | Penicillium
|
| Консистенция: ватная, край колонии: белый, обратная: темно коричневая. Размер: 5 – 8 мм, конидиальная зона: белая, экссудат: отсутствует. | Penicillium | ||
| Консистенция: войлочная, край колонии: темно серый, обратная: темно серая. Размер: 20 мм, конидиальная зона: св. серая, экссудат: белый | Penicillium | ||
| Консистенция: зернистая, край колонии: белый, обратная: св. коричневая, размер: 15 - 30 мм, конидиальная зона: зеленая, экссудат: отсутствует | Aspergillus | ||
| Консистенция: хлопьевидная, край колонии: белый, обратная сторона: пурпурная. Размер: 15 - 20 мм, конидиальная зона: желтая, экссудат: отсутствует. | Fusarium | ||
| Консистенция: зернистая, край колонии: серый, обратная сторона: белая. Размер: 10 – 15 мм, конидиальная зона: желто - зеленая, экссудат: отсутствует. | Penicillium | ||
| Консистенция: зернистая, край колонии: серый, обратная сторона: св. коричневая. Размер: 50 мм, конидиальная зона: серая, экссудат: отсутствует | Penicillium. | ||
| Консистенция: войлочная, край колонии: коричневый, обратная сторона: коричневая. Размер: 8 мм, конидиальная зона: св. коричневая, экссудат: отсутствует. | Aspergillus |
В числе исследуемых проб грунта, среди грибов, доминирующее положение занимают р. Aspergillus, р. Penicillium.Численность грибов варьирует от 1,5 – 3,6∙ 105 кое/г грунта. В удаленных и труднодоступных местах количество грибов значительно меньше, чем в местах активно посещаемых туристами. В исследуемых пробах, дрожжи обнаружены не были.
Количество БГКП варьирует в допустимых пределах, от менее 9 до 10 клеток /г. Но наличие даже такого незначительного количества БГКП, может свидетельствовать об антропогенном загрязнение пещеры.
Сводная таблица определения численности микроорганизмов в пробах грунта пещеры Баскунчакская.
| Место отбора проб | Численность микроорганизмов кое/г | |||
| Сапротрофы | Микромицеты | БГКП | ||
| Коли-индекс | Коли- титр | |||
| Горизонтальный шкуродер | 7,5 | 10 | 91 | |
| Галерея входа №2 | 9,1 | 9 | 111 | |
| Галерея входа № 3 | 7,05 | <3 | >333 | |
| Главная Галерея | 5,2 | 18,75 | - | - |
| Вертикальный шкуродер | 1,7 | 10,78 | - | - |
| Лабиринт | 1,05 | 7,75 | 7 | 143 |
| Галерея входа № 2 | 16,55 | 9 | 111 | |
| Грязевой сифон | 35,8 | - | - | |
| В районе горизонтального шкуродера | 26,2 | 9 | 111 | |
Основываясь на полученных результатах можно сделать следующее заключение:
1) в пробах отобранных в грунте пещеры Баскунчакская были обнаружены преимущественно Г «+» споровые палочки. Предположительно обнаруженные микроорганизмы можно отнести к следующим родам: Bac.megaterium, Bac.suрtiles, Bac. mesentericus.
2) Помимо сапротрофной микрофлоры были обнаружены плесневые грибы, доминирующее положение занимают р. Aspergillum, р. Penicillium. Численность грибов варьирует от 1,5 – 3,6∙ 105 кое/г грунта. В удаленных и труднодоступных местах количество грибов значительно меньше чем в местах активно посещаемых туристами. Также среди грибов был обнаружен р. Fusarium, многие виды которого являются патогенными для человека. При визуальном осмотре пещеры, на местах стоянок туристов, на грунте, были обнаружены колонии грибов, предположительно относящихся к роду Penicillium.
Гетеротрофные микроорганизмы и грибы, обнаруженные в пещере, могут являться индикаторами рекреационного влияния, оказываемого на нее, как на объект туристического значения в результате эксплуатации пещеры в качестве экскурсионного объекта.
3)БГКП были обнаружены в пределах нормы. В труднодоступных местах отмечается их полное отсутствие. Незначительное наличие БГКП также свидетельствует об антропогенном загрязнении пещеры.
Вывод
Основываясь на полученных результатах можно сделать следующие выводы:
1.В пробах, отобранных в грунте пещеры Баскунчакская, среди сапротрофов, доминирующее положение занимают микроорганизмы, предположительно относящиеся к следующим родам: Bac.megaterium, Bac.suрtiles, Bac. mesentericus. Общее микробное число, варьирует от 7,5 ∙ 107 до 1,05 ∙ 106 кое/г. Среди микромицетов доминируют р. Aspergillus р. Penicillium.Численность грибов варьирует от 1,5 – 3,6∙ 105 кое/г грунта.
2. Количество БГКП варьирует в допустимых пределах, от менее 9 до 10 клеток /г. Но наличие даже такого незначительного количества БГКП, может свидетельствовать об антропогенном загрязнение пещеры.
Список литературы
1. Асонов Н.Р. Микробиология.-2-е изд., перераб. и доп.- М.:
АгропромиздатЮ1989.-350с.
2.Вербина Н.М. Гидромикробиология с основами общей микробиологии. - М.: «Пищевая промышленность», 1980. – 288с.
3.Государственный природный заповедник. «Богдинско - Баскунчакский»
Астрахань. 1998.
4. Методические указания по количественному учету микроорганизмов для студентов специальности 012400 «Микробиология», Куликова И.Ю., 2004-35с.
5.Кочемасов З.Н. Ефремова С.А. Санитарная микробиология и вирусология. – М.: Медецина, 1987. – 352с.
6.Мищустин Е.Н. Микробиология. - М.: Агропромиздат, 1987-338с.
7.Нетрусов А.П
8. Определитель бактерий Берджи. В 2 – х т.: перевод с англ./ Под ред.
Дж. Хоулта, Н.Грига, П.Снита, Дж. Стейли, С. Уильямса – М.: Мир,
1997. – 364с.
9. Расанов Н.Р. Микробиология. М.: Колос, 1989.
10. Теппер Е.З. и др. Практикум по микробиологии Учеб. пособие для вузов. М.: Агропромиздат, 1987. – 237с.
11. http:⁄⁄ www.ecocave.ru.
0 комментариев