ДНК-діагностика та її застосування у ветеринарії

Міністерство освіти і науки України Реферат Тема: ДНК-діагностика та її застосування у ветеринарії 2010

Зміст

Вступ

1.  ПЛР – основний метод ДНК - діагностики

2.  Проведення полімеразної ланцюгової реакції

3.  Переваги ПЛР - діагностики інфекційних захворювань тварин

Висновки

Список використаних джерел

Вступ

Інфекційна патологія у ветеринарії охоплює широке коло хвороб, різних як по характеру течії (гострі, хронічні, латентні), ступені розповсюдження (від спорадичних випадків до епізоотії), так і по складності їх діагностики. Важливе, а при деяких хворобах вирішальне значення мають серологічні дослідження, направлені на виявлення антитіл, що виробляються організмом тварини у відповідь на впровадження інфекційного агента або вакцини. Не дивлячись на ряд переваг, методи, засновані на цьому принципі, володіють недостатньою чутливістю і специфічністю. Істотний прорив був зроблений останніми роками, коли для діагностичних цілей привернули методи генної інженерії і біотехнології. Для діагностики інфекційних захворювань найбільшого застосування знайшов спосіб ампліфікації (множення) нуклеїнових кислот: полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР), лігазна ланцюгова реакція, NASBA-метод та ін [1].

Метою даної роботи було виявити основні переваги і ефективність методу ДНК-діагностики, а також впровадження його в систему державної ветеринарної служби.

У роботі були поставлені наступні завдання:

-  дати комплексну оцінку методу ПЛР-діагностики;

-  визначити переваги ПЛР-діагностики інфекційних захворювань;

-  розглянути деякі види патологій тварин, при яких цей метод грає важливу роль.

1. ПЛР – основний метод ДНК-діагностики

ПЛР в лабораторній діагностиці інфекцій характеризується швидкістю, неперевершеною чутливістю і високою специфічністю, що дозволяє виявляти мікроорганізми, присутні в дуже низьких концентраціях (1-10 збудників в пробі). При цьому ДНК інфекційних агентів може бути достатньо ефективно екстрагована з будь-якої біологічної рідини або тканини, а також з проб об'єктів навколишнього середовища (грунти, води і так далі) і продуктів харчування. Полімеразна ланцюгова реакція ефективна при виявленні бактерійних, грибкових, паразитарних і вірусних патогенів.

Одним словом, це метод, заснований на принципі ампліфікації, — ізольованого множення гена або його певного фрагмента. Ампліфікація — один із способів виживання мікроорганізмів і клітин тварин в умовах дії протипухлинних і протибактерійних препаратів. ПЛР дозволяє проводити аналогічний процес in vitro, тобто в пробірці.

Основні положення ампліфікації ДНК in vitro були обгрунтовані співробітником корпорації "Cetus" (США) Кері Маллісом в 1983 році. Через 10 років за цю розробку він був удостоєний Нобелівської премії по хімії.

Метод базується на добудові ферментом (термостабільна ДНК-полімераза) олігонуклеотидных затравок (праймерів), приєднаних до денатурованої низькокопійованій ДНК-матриці. Праймери визначають специфічність реакції і величину фрагмента. Процес ампліфікації включає багатократне повторення певних циклів, як правило, 30-40. Кожен складається з трьох основних стадій: денатурація ДНК, відпалу (приєднання) і добудови праймерів.

На першій стадії дволанцюгова ДНК-матриця денатурується при 94°С з утворенням одноланцюгових ДНК. На другій температура знижується до 55-65° С і відбувається приєднання праймерів до кожної з двох одноланцюгових ДНК. На третій фермент (термостабільна ДНК-полімераза) при температурі 72° С добудовує обидва праймери в напрямі від 3-го до 5-го кінця, внаслідок чого утворюється дволанцюгова ДНК.

Після першого циклу створюються довгі фрагменти, оскільки полімераза добудовує праймери, використовуючи як матрицю весь геном. У наступних циклах праймери відпалюють із знов синтезованими молекулами ДНК. Полімераза зупиняється, доходячи до кінця цих молекул, тобто до праймерів, використаних в попередньому циклі. Після кожного циклу число молекул матриці подвоюється, в результаті відбувається експоненціальна ампліфікація фрагмента ДНК-матриці. Це дозволяє за 25-40 циклів накопичити ПЛР-продукт в достатній кількості для візуальної детекції після електрофоретичного розділення і фарбування бромистим етидієм [1].

Основні компоненти ПЛР

1. Два синтетичних олігонуклеотидних праймера (завдовжки приблизно по 18-25 нуклеотидов). Кожен з них комплементарний одному з ланцюгів матриці, що обмежує початок і кінець ампліфікуючої ділянки. Специфічність реакції в основному визначається температурою відпалу праймерів, при якій відбувається їх комплементарна взаємодія з ДНК-матрицею. Температура залежить від довжини праймера і змісту G-C пар (З — гуанин, З — цитозин). Як правило, вона варіюється в діапазоні 50-64° С. Дизайн праймерів здійснюється з використанням спеціальних комп'ютерних програм і автоматичного ДНК-синтезатора.

2. Термостабільна ДНК-полімераза— фермент, який каталізує реакцію полімеризації ДНК. Полімераза для використання в ПЛР повинна зберігати активність при високій температурі тривалий час, тому використовують ферменти, виділені з термофілів, — Thermus aquaticus (Taq-полімераза), Pyrococcus furiosus (Pfu-полімераза), Pyrococcus woe-sei (Pwo-полімераза) та інші.