Навигация
Выяснение начальной последовательности секвенируемого фрагмента ДНК
22808
знаков
0
таблиц
0
изображений
1. Выяснение начальной последовательности секвенируемого фрагмента ДНК
а) Если о нем ничего неизвестно, то можно воспользоваться «устаревшим» методом Максама и Гилберта, который для первых десятков нуклеотидов достаточно быстро дает вполне надежные сведения.
б) В случае, если нас интересует секвенирование определенного гена, направляющего биосинтез вполне конкретного белка известной структуры, и если есть основание полагать, что этот ген (или хотя бы его начало) входит в состав обследуемого фрагмента ДНК. А значит и такой же длины начальную последовательность дезоксирибонуклеотидов соответствующего гена. Синтезированный праймер в этом случае просто воспроизведет расшифрованную часть иРНК.
2. Присоединение к началу секвенируемого фрагмента известной последовательности ДНК для синтеза праймера по ней.
Эту операцию мы уже, по существу говоря, проделывали, когда рассматривали возможность встраивания фрагментов чужеродной ДНК, длиною в тысячи нуклеотидов, в плазмиды. Полная последовательность нуклеотидов для множества плазмид (находящихся в продаже) хорошо известна. Таким образом мы можем естественным образом связать начало (и конец) секвенируемого фрагмента ДНК с известной последовательностью нуклеотидов плазмиды.
Встает вопрос: как узнать точно в какое место плазмиды включился наш фрагмент и как его потом «вырезать» обратно вместе с известным, ему предшествующим куском плазмиды — достаточным по своим размерам для посадки на него надежного праймера? Для ответа на этот вопрос следует вспомнить о существовании (и доступности на рынке) плазмид с «поликлоновым сайтом», насчитывающим несколько десятков пар оснований, искусственно синтезированном так, чтобы содержать в себе «сайты узнавания» для многих рестриктаз.
Для решения нашей задачи надо подобрать две рестриктазы, сайты узнавания которых в пределах поликлонового сайта отстояли бы друг от друга достаточно далеко, на расстояние, большее, чем длина будущего праймера секвенирования. Одна рестриктаза, сайт узнавания которой находился бы в «конце» поликлонового сайта (если мы определились с направлением будущего секвенирования), должна послужить для встраивания подлежащего секвенированию фрагмента ДНК. Вторая — для его последующего вырезания из плазмиды вместе с участком поликлонового сайта разделявшим сайты узнавания обеих рестриктаз. Вся последовательность нуклеотидов на этом участке известна и потому синтезировать комплементарный к нему праймер не представит труда.
Последующее секвенирование таким образом удлиненного фрагмента нашей ДНК либо начнется с его первого нуклеотида, либо с нескольких предшествующих нуклеотидов, относящихся к копированию присоединенного участка поликлонового сайта. Эти нуклеотиды легко узнать и отделить от последовательности самого исследуемого фрагмента ДНК.
Естественно, что ввиду такой определенности ситуации, фирмы-поставщики плазмид с поликлоновыми сайтами предлагают и готовые праймеры (обычно 18-членные), которые они вправе называть «универсальными», ибо они пригодны для секвенирования любых фрагментов ДНК, таким образом подготовленных.
В последнее время для умножения количества секвенируемой ДНК клонированием и создания места посадки праймера стали широко использовать бактериофаг М13. Это — нитевидный фаг, содержащий однонитевую, полностью расшифрованную ДНК. В нее, с помощью рестриктаз, точно так же, как в плазмиду можно встроить чужеродную ДНК. Попадая в клетку E.coli этот фаг приобретает двунитевую структуру и таким образом размножается в клетке («репликативная форма») до более чем 100 копий. Во время деления клетки продолжает размножаться и фаговая ДНК. Но одновременно с этим клетка E.coli (не погибая!) выбрасывает в питательную среду готовые фаговые частицы опять в виде однонитевой ДНК, одетой белком. После удаления E.coli центрифугированием, свободные фаги обрабатывают фенолом и получают однонитевую ДНК фага вместе с изначально встроенным в нее фрагментом чужеродной ДНК. Разобравшись таким образом с проблемой праймера, займемся другими важными практическими аспектами секвенирования ДНК.
Во-первых отметим, что в процессе секвенирования матричная ДНК должна все время оставаться строго однонитевой, без возможных «шпилек» — локальных двунитевых участков, образующихся в силу наличия в этой ДНК близко расположенных, пусть небольших, но комплементарных последовательностей. То же самое относится и к меченым отрезкам ДНК в процессе их разделения электрофорезом. Как мы увидим ниже, в процессе комплементарного синтеза по методу Сэнджера (он повторяется многократно — в несколько циклов) такая опасность не возникает, так как в каждом цикле имеется стадия предварительной полной денатурации при температуре 96°С, а само копирование осуществляется при температуре 60°С. Но электрофорез приходится проводить в сильно денатурирующей среде: 80% -ном растворе формамида, содержащим 5 mM раствор ЭДТА Во-вторых, следует озаботиться тем, чтобы при электрофорезе количество флюоресцентно меченого материала в каждой полосе (даже такой, в которой содержится наименьшее число отрезков ДНК) было достаточным для надежной регистрации. Вместе с тем, этого желательно добиться без чрезмерного расходования исходного материала ДНК, который обычно дефицитен.
Поэтому реакцию ограниченного (включением дидезоксирибонуклеотида) матричного синтеза на том реальном количестве секвенируемой ДНК, которое направляется в эксперимент, повторяют многократно. Это делается точно так же, как в рассмотренной ранее симметричной ПЦР-реакции. Но с тем отличием, что используется только один, начальный праймер («асимметричная ПЦР-реакция»). Этап элонгации заканчивается по достижении конца матрицы (если он не был остановлен раньше). Комплементарный синтез от второго праймера в обратном направлении здесь не фигурирует.
Подобно тому, как это описано в главе 6, здесь готовят 20 мкл инкубационной смеси, в которой содержится: одно или двуните-вая нить ДНК секвенируемого фрагмента (в последнем случае будет копироваться только одна из нитей — та, для которой синтезирован праймер), избыточное количество 4-х нормальных дезоксирибонуклеозидтрифосфатов, ограниченное количество 4-х флюоресцентных дидезоксирибонуклеозидтрифосфатов, термостабильная Taq ДНК-полимераза и в достаточном количестве синтетический праймер (все это в буфере с MgClg). Инкубационная смесь прогревается предварительно в тонкостенной полипропиленовой пробирочке емкостью в 0,2 или 0,5 мл при 96 °С для полной денатурации ДНК. Затем ее помещают во встроенный в прибор термоблок, где автоматически осуществляется 25 последовательных циклов, каждый из которых состоит из следующих, очень быстро сменяющих друг друга термических экспозиций:
— 10 секунд при 96 °С,
— 5 секунд при 50 °С,
— 4 минуты при 60°С.
Экспозиция при 96°С освобождает однонитевые матричные молекулы секвенируемой ДНК от новосинтезированных укороченных копий своей последовательности вместе с праймерами и Taq ДНК-полимеразой.
При 50 °С новые молекулы праймера гибридизуются с начальными участками освободившихся матриц. Вслед за ними на эти матрицы садятся и молекулы Taq ДНК-полимеразы.
В течение 4-х минут они ведут комплементарный синтез ДНК вплоть до момента случайного включения флюоресцентно меченого дидезоксирибонуклеотида.
Количество копий при таком однонаправленном синтезе не увеличивается многократно, как при симметричной ПЦР-реакции с двумя праймерами, а возрастает в лучшем случае всего в 25 раз — по числу циклов. Однако и этого оказывается достаточно для того, чтобы ограничить количество исходно вносимой ДНК 0,2 или 0,5 микрограммами (соответственно для однонитевой или двунитевой молекулы). В интересах реальной ориентировки, не мешает заметить, что для фрагмента двунитевой ДНК длиной в 1000 пар нуклеотидов в 0,5 мкг содержится более 1011 копий этого фрагмента. В каждом из циклов ПЦР-реакции все они снова и снова выступают в качестве матриц для случайным образом укороченных копирований. Это обеспечивает в конце концов достаточное число одинаковых по длине отрезков флюоресцентномеченой ДНК в любой полосе электрофоретического разделения.
Впрочем, во избежание флюоресцентного фона смесь этих отрезков следует очистить от неиспользованных меченых дидезоксинулеозидтрифосфатов. С этой целью новосинтезированные отрезки ДНК (вместе с исходными, немеченными матрицами) осаждают добавлением 1 мл 70%-го этанола и центрифугированием в микропробирках на 1,5 мл. Осадок растворяют в 4 мкл 80%-ного формамида с ЭДТА, прогревают при 96°С 2 минуты и в количестве 2 мкл вносят на старт трека пластины ПААГ.
Литература
1 Курашвили Л.В., Васильков В.Г., Келина Н.Ю. Функция печени и состояние липидного обмена у больных до и после оперативного вмешательства на желудочно-кишечном тракте. //Анестезиология и реаниматология. - 1996. - N 3. - С.21-25.
2 Курашвили Л.В., Васильков В.Г., Келина Н.Ю. Состояние метаболизма и гемодинамики печени у больных с хирургической абдоминальной патологией в процессе интенсивной терапии. - IX Европейский конгресс. - 1996. - Глазго.
Похожие работы
... нуклеотидов. Благодаря измерению интенсивности каждого цвета флюоресценции вершины пиков хорошо различимы. Здесь необходимо сделать небольшое отступление. Хотя и было сказано, что рассматривать различные модели секвенаторов не имеет смысла, об одной из них, принадлежащей к последнему поколению, стоит вкратце написать и вот почему. Принципиальное его устройство такое же, но в интересах ...
сте с этим закончился прежний, классический этап в развитии естествознания, характерный для эпохи Нового времени. Наступил новый этап неклассического естествознания XX века, характеризующийся, в частности, новыми, квантово-релятивистскими представлениями о физической реальности. 2. Научно-техническая революция и ее естественнонаучная составляющая Новые явления и процессы, имевшие место в ...
... олигонуклеотидов—одну полуавтоматическую, а вторую в комплексе с компьютером. В 1982 г. цена этих приборов на американском рынке составляла 36000—39500 долл.[2]. К открытиям связанным с достижениями генной инженерии нужно прибавить то, что огромный генетический «чертеж» многоклеточного существа просчитан полностью. Я думаю это можно назвать достижением века. После восьми лет работы многих ...
... типов биокомпьютеров, которые базируются на разных биологических процессах. Это, в первую очередь, находящиеся в стадии разработки ДНК- и клеточные биокомпьютеры. 1. Биокомпьютеры или живые компьютеры 1.1. ДНК-компьютеры Как известно, в живых клетках генетическая информация закодирована в молекуле ДНК (дезоксирибонуклеиновой кислоты). ДНК - это полимер, состоящий из субъединиц, ...
0 комментариев