26 июня 2003 г.
№ гос. рег. МН-7.3519-0204
ИНСТРУКЦИЯ ПО ПРИМЕНЕНИЮ
набора иммунофлюоресцентного для выявления
возбудителя болезни Лайма в переносчиках
Набор представляет собой комплект, основным компонентом которого является иммунная сыворотка, содержащая антитела к возбудителю болезни Лайма (БЛ).
Основное свойство набора – способность выявлять возбудителя БЛ в переносчиках за счёт специфического взаимодействия антител иммунной сыворотки с антигеном возбудителя. Комплекс антиген-антитело выявляют с помощью антивидовой сыворотки, меченой флюоресцеинизотиоционатом (ФИТЦ), дающей чётко выраженное изумрудно-зелёное свечение микробных клеток возбудителя при люминисцентном микроскопировании. Все компоненты набора являются неинфекционными.
1. НАЗНАЧЕНИЕ
Набор предназначен для выявления антигена – возбудителя БЛ (Borrelia burgdorferi sensu lato) в переносчиках методом, базирующемся на реакции непрямой иммунофлюоресценции (РНИФ).
Основными переносчиками возбудителя Лайм-боррелиоза являются иксодовые клещи - I. ricinus, реже боррелии обнаруживаются в клещах D. reticulatus. Могут быть исследованы случайные переносчики – другие кровососущие членистоногие приподозрении на вероятность наличия у них возбудителя БЛ.
Исследованию подлежат живые особи любой стадии развития (голодные и напитавшиеся), а также погибшие (без признаков плесени), высохшие переносчики (после их размачивания в цитратно-фосфатном буферном растворе (ЦФБ) при 4-6°С в течение 12-24 часов). Могут быть исследованы фрагменты клеща (часть брюшка).
2. СОСТАВ НАБОРА
2.1. Иммунная сыворотка, готова к использованию, 1,5 мл – 1 пр-ка
2.2. (К+)-антиген возбудит. БЛ, готов к использов., 0,2 мл – 1 пр-ка
2.3. Конъюгат, готов к использованию, 1,5 мл – 1 пр-ка
2.4. Концентрат ЦФБ, 25х, 20 мл – 4 фл.
2.5. Предметные стёкла с лунками, – 3 шт.
2.6. Предметные стёкла без лунок, – 1 шт.
3. ПРИГОТОВЛЕНИ ЦФБ, РАЗЛИВ И ХРАНЕНИЕ КОМПОНЕНТОВ
3.1. Приготовление ЦФБ (цитратно-фосфатного буферного раствора), рН 7,2-7,4: содержимое 1 флакона (п. 2.4.) разводят дистиллированной водой до объёма 500 мл. (Если во флаконе с концентратом ЦФБ образовались кристаллы солей, их предварительно растворяют, помещая флакон в тёплую воду.) проверяют и в случае необходимости коррегируют рН. Применяется для приготовления суспензий из переносчиков, отмывки предметных стёкол. Хранение при 4-6°С до 1 недели.
3.2. Иммунную сыворотку (п.2.1.) разливают на несколько порций из расчёта 10 мкл (0.01 мл) на лунку и хранят до использования при -20°С. Размороженный реагент может храниться при 4-6°С в течение 72 часов.
3.3. К+ (п. 2.2.) разливают порциями по 20 мкл (0.02 мл) и хранят до использования при -20°С. Размороженный реагент может храниться при 4-6°С в течение 72 часов.
3.4. Конъюгат (антивидовые иммуноглобулины, меченые ФИТЦ) с раствором Эванса голубого (п. 2.3.) разливают на несколько порций из расчёта 10 мкл (0,01 мл) на лунку и хранят до использования при -20°С. Размороженный реагент может храниться при 4-6°С 72 часа.
4. ПРОВЕДЕНИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ПЕРЕНОСЧИКОВ
4.1. Подготовка к исследованию.
4.1.1. Чистые предметные стёкла с лунками и без лунок ополаскиваются дистиллированной водой и досуха протирают марлевой салфеткой.
4.1.2. Иммунную сыворотку (п.2.1.), К+ (п. 2.2.) и конъюгат (п. 2.3.) размораживают при комнатной температуре. Готовы к применению.
4.1.3. На предметное стекло без лунок наносится капля ЦФБ объёмом 10-20 мкл (0,01- 0,02 мл) в зависимости от размера переносчика. При исследовании сильно напитавшихся самок клещей объём капли может быть увеличен до 50 мкл (0,05 мл). исследуемого членистоногого помещают в каплю брюшком кверху и0, придерживая глазным пинцетом, либо другим инструментом, иссекают его тело препаровальной иглой.
4.2. Постановка РНИФ.
4.2.1. В лунку предметного стекла переносят жидкую фракцию приготовленной суспензии (10-20 мкл), не допуская попадания крупных частиц.
4.2.2. В одну или две свободные лунки предметного стекла вносят по 10 мкл (0,01 мл) антигена возбудителя БЛ (К+).
4.2.3. препарат высушивают при комнатной температуре или в термостате (при 37°С), ополаскивают дистиллированной водой и снова высушивают.
4.2.4. Затем во все лунки вносят по 10 мкл (0,01 мл) иммунной сыворотки. инкубируют во влажной камере при 37°С 30 минут.
4.2.5. По окончанию инкубации стекло ополаскивают дистиллированной водой и отмывают в ЦФБ в течение 15 минут на магнитной мешалке или вручную, снова ополаскивают дистиллированной водой и высушивают.
4.2.6. В каждую лунку вносят по 10 мкл (0,01мл) конъюгата. Инкубируют во влажной камере при 37°С в течение 30 минут.
4.2.7. по окончании инкубации стекло ополаскивают дистиллированной водой, отмывают в ЦФБ в течение 15 минут на магнитной мешалке или вручную, снова ополаскивают дистиллированной водой и высушивают.
5. УЧЁТ РЕАКЦИИ И ОЦЕНКА РЕЗУЛЬТАТОВ
Препарат исследуют в люминесцентном микроскопе типа «Люмам» с водно-иммерсионным объективом х70, тубусом х1,6 и окуляром не менее х6,3 или масляным иммерсионным объективом х90, тубусом х1,1 и окуляром не менее х5.
Сначала исследуют лунки с положительным контролем. К просмотру материала приступают только в том случае, если в лунках с К+ наблюдается чётко выраженная изумрудно-зелёная окраска антигена (боррелий). Каждую лунку препарата внимательно просматривают, обращая внимание на периферийные и свободные от посторонних частиц зоны. Обнаружение окрашенных в ярко зелёный цвет спирохет, идентичных в лунках с К+, даже в единичных экземплярах, расценивается как положительный результат. Следует иметь в виду, что при исследовании фрагментов клещей или сильно напитавшихся самок, отрицательный результат может быть менее достоверен, чем при исследовании голодных или слабо напитавшихся клещей.
ПРИМЕЧАНИЕ:
Отработанные предметные стёкла могут быть использованы повторно после их дезинфекции в 6% растворе перекиси водорода в течение 30 минут, мытья в растворе детергента, прополаскивания в проточной, а затем в дистиллированной воде и высушивания.
6. ФОРМА ВЫПУСКА
Набор иммунофлюоресцентный для выявления возбудителя БЛ в переносчиках выпускается в виде упакованного комплекта. Один набор рассчитан на проведение 120 исследований, включая контроль.
7. УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ И ТРАНСПОРТИРОВКИ
Набор хранится при температуре -20°С. При транспортировке следует избегать размораживания. При случайном размораживании необходимо убедиться, что при проведении контроля К+ с иммунной сывороткой отмечается чёткий положительный результат. В этом случае набор можно использовать по назначению. флаконы с концентратом солей для приготовления ЦФБ и предметные стёкла можно хранить при любой температуре. Сроки годности набора (6 месяцев со дня выпуска) указан на этикетке. Дальнейшее использование данной серии возможно после проведения повторного контроля антигена возбудителя БЛ (п. 2.2.) с иммунной сывороткой (п.2.1.).
Приложение 5
Инструкция по профилактике заболеваний весенне-летним энцефалитом и болезнью Лайма. (Памятка населению)
1. Одежда для посещения леса, особенно в весеннее время, должна быть из плотной, неворсистой ткани, плотно облегать кисти рук и голень, лучше на резинках или на манжетах. Лучшая обувь – резиновые сапоги, в которые заправляются брюки.
2. При выборе мест отдыха, туристических стоянок или просто прогулок по лесу следует избегать участков леса с обилием кустарниковой растительности, высокой травы и ельников – это излюбленные места обитания клещей.
3. Своевременное удаление ползающих по телу и присосавшихся клещей является эффективным средством предупреждения заболеваний. После каждого посещения леса необходимо проводить самоосмотр тела или взаимоосмотры.
4. Главное правило – не дать возможность клещу вас укусить. Менее 1% клещей в Беларуси заражены вирусами Лайм-боррелиоза и энцефалита. Самцы кровью не питаются, опасность представляют самки, личинки и нимфы.
5. Приведенных с прогулки собак, необходимо тщательно осмотреть, удалить клещей, не пускать в спальные помещения. Это относится к любым животным, посещающим лес.
6. Не рекомендуется оставлять в спальных помещениях букеты цветов, ягоды, другие предметы, принесённые из леса – на них могут также находиться клещи.
7. Одежду, в которой посещали лес, следует тщательно вытряхнуть и поместить вне жилых помещений.
8. Если клещ всё-таки смог присосаться, его следует осторожно расшатывая, отделить от тела, стараясь не оторвать хоботок, и сжечь на огне. Ни в коем случае не раздавливать ногтями или пальцами. Это может привести к механическому заражению при попадании вируса на слизистые оболочки глаз, рта, носа или кожные ранки.
9. Если укуса избежать не удалось, необходимо внимательно следить за своим состоянием своего здоровья в течение нескольких недель после укуса клеща. При появлении симптомов заболеваний, срочно обращайтесь к врачу.
10.Симптомы клещевого энцефалита: общее недомогание, постоянная головная боль, повышенная температура, боли в шее при наклонах головы вперёд, потеря равновесия при глубоких наклонах тела.
11. Для экспресс-профилактики КЭ при присасывании иксодовых клещей рекомендуется применять антибиотик линкомицин, который активно подавляет репродукцию вируса. Препарат назначают перорально по 1 таблетке 3 раза в день в течение 4–5 дней в первые 2–3 дня после укуса. Еще более эффективным является обкалывание места присасывания клещей линкомицином. При позднем обращении за медицинской помощью (4–5-й день после укуса клеща) линкомицин следует назначать парентерально в фармакопейных дозах (Цвирко Л.С., Мишаева Н.П., Згировская А.А., Савицкий Б.П., 2003).
0 комментариев