Исследование клеточного цикла методом проточной цитометрии

БЕЛОРУССКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

Биологический факультет

кафедра генетики и биотехнологии

ИССЛЕДОВАНИЕ КЛЕТОЧНОГО ЦИКЛА МЕТОДОМ ПРОТОЧНОЙ ЦИТОМЕТРИИ

Курсовая работа

студентки 3 курса ШУТ М.В.

Научный руководитель:

канд. биол. наук,

доцент ГЛУШЕН С. В.

Минск 2001г.

 

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ………………………………………………………………..3

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ……………………………………………………4

1.Общие принципы проточной цитометрии ……………………..4

2. Анализ ДНК-гистограмм ……………………………………….5

3. Анализ параметров клеточного цикла………………………….9

4.Наиболее употребительные методики, используемые

в цитометрии клеточного цикла………………………………..14

5.Применение цитометрии в молекулярной

клинической диагностике………………………………………..17

 

ЗАКЛЮЧЕНИЕ…………………………………………………………..22

ЛИТЕРАТУРА…………………………………………………..23

ВВЕДЕНИЕ

Возможности применения методов количественной цитометрии в биологических и медицинских исследованиях очень широки. Они включают множество задач, начиная от поиска наиболее информативных морфометрических и цитоспектрофотометрических критериев кинетики ДНК в клеточном цикле и кончая многопараметрическим изучением гетерогенных популяций исследуемых объектов. Хотя эти задачи могут решаться на различных экспериментальных моделях или клиническом материале, общие принципы остаются одинаковыми как для тех, так и других объектов.

В настоящее время цитометрию принято подразделять на проточную и статическую. Первый вариант цитометрии осуществляется с помощью специальных приборов – проточных цитометров и сортеров. Для статической цитометрии могут быть использованы конфокальные микроскопы, а также более простые и дешевые системы анализа изображений, смонтированные на обычных люминесцентных микроскопах. Существует много методик, которые с одинаковым успехом можно воспроизводить как с помощью проточной, так и статической цитометрии. Более того, статическая цитометрия в некоторых случаях позволяет получить более обширную информацию о клетках, причем ее производительность не намного меньше проточной.

Настоящий обзор литературы посвящен применению цитометрии для оценки параметров клеточного цикла на экспериментальном и клиническом материале. Хотя в обзоре в основном приводятся сведения, касающиеся проточной цитометрии, с учетом изложенного выше они в значительной степени распространяются также и на статическую цитометрию.

  ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

 1.Общие принципы проточной цитометрии

Метод проточной цитометрии сформировался за последние 30 лет на основе отдельных опытов по подсчету числа частиц и определению их размеров. В 1965 г. появилось первое сообщение о клеточном сортере, а в 70-х годах стали выпускать приборы, способные измерять интенсивность флуоресценции при двух и более длинах волн и определять сразу несколько клеточных параметров.

 В настоящее время выпускают два основных типа приборов для проточной цитометрии: 1) простые в использовании аппараты, которые могут измерять флуоресценцию при двух и более длинах волн и светорассеяние под углом около 10º (малоугловое прямое рассеяние) и 90º; 2) большие клеточные сортеры, которые не только измеряют пять и более клеточных или ядерных параметров, но и сортируют частицы с заданным набором этих параметров.

Принципы проточной цитометрии весьма просты. Клетки или ядра поодиночке пересекают сфокусированный световой пучок, обычно лазерный. Свет определенной длины возбуждает молекулы флуоресцирующих красителей, связанных с различными клеточными компонентами, при этом при этом может происходить одновременное возбуждение нескольких разных красителей, что позволяет оценить сразу несколько клеточных параметров. Свет, испускаемый красителями, собирают с помощью системы линз и зеркал и разлагают на компоненты. Световые сигналы детектируют, преобразуют в электрические импульсы и далее в форму, удобную для компьютерной обработки и хранения информации.

Методом проточной цитометрии можно получать самые разные данные: определять содержание в клетке ДНК и РНК, суммарное количество белков и количество специфических белков, узнаваемых моноклональными антителами, исследовать клеточный метаболизм (например, измерять внутриклеточный рН), изучать транспорт ионов кальция и кинетику ферментативных реакций (M.G.Ormerod, 1990).

В продаже имеются разные проточные цитометры, и изложить общие принципы их работы сложно. Можно отметить лишь несколько моментов, общих для всех приборов:

–      для анализа необходимы гомогенные суспензии изолированных клеток;

–      клетки или ядра должны иметься в достаточном количестве;

–      для устранения эффектов, связанных с возможной агрегацией клеток, необходимо использовать всю доступную информацию, например данные по рассеянию света в объеме и отношение площади пика к его ширине.