Культивирование крови, приготовление препаратов хромосом и анализ цитогенетических нарушений

2.2. Культивирование крови, приготовление препаратов хромосом и анализ цитогенетических нарушений.

 Материалом для исследования являлась цельная периферическая кровь, которую забирали у доноров в асептических условиях, с немедленным помещением в гепаринизированный флакон (0,5% раствор гепарина ф."Рихтер"). Посев культур проводили в течении суток после взятия крови.

Для анализа хромосом осуществляли подготовку препаратов с использованием стандартного полумикрометода культивирования лимфоцитов [Hungerford et al., 1965]. Фиксацию материала проводили в 3-х сменах охлажденного этанол-уксусного фиксатора (3:1). Клеточную суспензию раскапывали на чистые охлажденные, смоченные водой предметные стекла. Препараты сушили над пламенем спиртовки, шифровали и окрашивали 2% раствором красителя Гинзы.

Учет хромосомных аберраций проводили согласно общепринятым требованиям [Бочков и др., 1972; Carrano, Natarajan, 1988]. Ахроматические пробелы (гепы) в число аберраций не включали и учитывали отдельно. Для оценки цитогенетических эффектов определяли общее количество аберраций и их качественный спектр на 100 проанализированных метафаз от каждого донора.

Статистическую обработку фактического материала проводили с использованием программы “STATISTICA for WINDOWS 5.0”; сравнение экспериментальных групп выполняли методом непараметрической статистики Манна-Уитни.

Глава III. Результаты и обсуждение

Дифференцированное кариотипирование, проведенное в изучаемых группах, позволило установить наличие нормального кариотипа у всех обследованных детей (46,ХХ).

Цитогенетический анализ уровня спонтанных хромосомных аберраций в исследованных группах дал следующие результаты (табл.2). Из данных приведенных в таблице 2 видно, что средние частоты спонтанной повреждаемости хромосом в группах обследованных детей имеют существенные различия, что прежде всего отражает неодинаковые экологические параметры среды в сравниваемых районах. Так, уровень клеток с хромосомными аберрациями в группе детей, проживающих в п.Крапивинcкий составил в среднем 1,77±0,54%, что не превышает общепопуляционных значений спонтанного мутагенеза, известных из литературы [Бочков, Чеботарев, 1989; Gundy, Varga, 1983]. Таким образом, цитогенетический анализ показал, что воздействие мутагенных факторов среды в п. Крапивинском находится на фоновом уровне, а частота хромосомных аберраций, установленная для группы сравнения, по видимому, соответствует популяционному региональному уровню при отсутствии на человека интенсивного антропогенного воздействия [Дружинин и др., 1995, 1997].

 Вместе с этим, в группах детей, проживающих в Чебулинском районе были зарегистрированы средние частоты повреждаемости хромосомного аппарата, которые значительно превышают аналогичные показатели в выборке сравнения (табл.2). Наиболее неблагоприятные генотоксические эффекты выявлены в группе девочек из с. Усманка (9,96 ± 2,88 %); несколько меньшее значение характерно для группы детей из с. Дмитриевка (6,08 ± 0,97%), однако и в этом случае имеется достоверность различий по отношению к показателям мутаций в группе сравнения (Р = 0,000092).

Таблица 2

Уровень цитогенетических нарушений в обследованных группах

* При сравнении выборок: "Усманка" и "Крапивино" Р = 0,000312;

"Дмитриевка" и "Крапивино" Р = 0,000092;

"Усманка" и "Дмитриевка" Р = 0,707.

Обсуждая данные, приведенные в табл. 2, можно отметить, что большие значения стандартной ошибки средней в группах детей из Чебулинского района (2,88 для выборки "Усманка" и 0,97 для выборки "Дмитриевка") свидетельствуют о широкой вариабельности цитогенетического ответа на мутагенное воздействие. Действительно, индивидуальные значения частот хромосомных аберраций варьируют от минимальных показателей до 35,3% аберрантных клеток. Этот факт говорит, с одной стороны, о существовании индивидуальной чувствительности к генотоксическому действию. С другой стороны, факт наличия очень высоких частот мутаций хромосом у отдельных детей при полном или почти полном отсутствии мутагенного эффекта у другой части обследованных позволяет предположить, что данные выборки неоднородны по степени воздействия кластогенных факторов на отдельных их представителей.

Известно, что ДНК-повреждающие агенты могут быть различной природы: физической (все виды ионизирующего излучения), химической (химические мутагены) и биологической (вирусы). Для выяснения причинности наблюдаемых в той или иной популяции хромосомных нарушений важное значение имеет анализ качественного спектра регистрируемых аберраций [Бочков,1993]. Основанием для этого служит известный факт о наличии специфики в типах образующихся аберраций, характерных для ионизирующего излучения, по сравнению с аберрациями, вызываемыми химическими мутагенами [Evans, 1982]. Под воздействием облучения в клетках чаще возникают аберрации хромосомного типа, в частности - дицентрические хромосомы, которые считаются испытанным индикатором мутагенного воздействия радиоактивного излучения [Моссэ, 1990]. Такой анализ был проведен на следующем этапе эксперимента; его результаты представлены на рис.4.

Из гистограммы видно, что соотношение одиночных и парных фрагментов хромосом является сходным в двух группах детей из разных сел Чебулинского района (63%/24% для выборки "Усманка" и 67%/30% для выборки "Дмитриевка"). Такое соотношение аберраций хроматидного и хромосомного типа с явным превалированием первых над вторыми указывает на преимущественно химическую природу генотоксических агентов, действующих на детей из Чебулинского района. Вместе с тем, в качественном спектре мутаций в выборках "Усманка" и "Дмитриевка" имеются и определенные отличия. Так в выборке "Усманка" дицентрические хромосомы встречались с частотой 0,87±0,52%, тогда как в выборке "Дмитриевка" аналогичный показатель составил 0,25±0,13%. Следует отметить, что отмеченные частоты дицентроческих хромосом (особенно у детей из с.Усманка) являются достаточно высокими и превышают общепопуляционные значения этого типа аберраций: 0,16% [Bender et al., 1988]. Можно предположить, что причиной появления маркерных для лучевого воздействия мутаций хромосом у обследованных детей из Чебулинского района является хроническое воздействие малых доз радиации на данную популяцию. Это не кажется странным ввиду достаточно близкого расположения с. Усманка от места подземного испытания ядерного оружия (полигон расположен в 10-15 км. от этого населенного пункта).

Основная компонента генотоксических эффектов, выявленных в группах детей из Чебулинского района, все же имеет явную химическую природу и этот факт заставляет искать источник вероятного химического загрязнения среды. Так, например, в 5 километровой зоне от с. Усманка расположен могильник ядохимикатов, причем условия хранения токсических веществ явно не соответствуют нормативам. Можно предположить, что происходит периодическая утечка токсикантов в окружающую среду, что и влечет за собой появление выраженных мутагенных эффектов у детей, проживающих в сельской местности. К настоящему времени можно лишь полагать, что данное химическое соединение (соединения) помимо ДНК- повреждающей активности, обладает колхициноподобным действием, разрушая веретено деления клетки, что выражается в появлении большого числа мутаций геномного типа полиплоидных клеток (рис.4).

Таким образом, результаты цитогенетического обследования девочек-подростков, проживающих в с.Усманка и с. Дмитриевка свидетельствуют о крайне неблагоприятной эколого-генетической обстановке, имеющей место в этих населенных пунктах Чебулинского района, причем причинами этого неблагополучия могут быть факторы как лучевой, так и химической природы. Следствием высокого уровня мутаций может быть увеличение заболеваемости населения района, особенно в части нозологических форм, связанных с повышенной хромосомной нестабильностью: онкопатологии, иммунодефицитные состояния, нарушение репродуктивной функции. Медицинские и социальные последствия загрязнения окружающей среды для жителей Чебулинского района должны стать предметом дальнейшего изучения всех заинтересованных структур: административных, медицинских и экологических.

Выводы.

Результаты полученные в данной работе позволили сформулировать следующие выводы:

1. Уровень хромосомных мутаций в лимфоцитах крови девочек-подростков, проживающих в селах Усманка и Дмитриевка Чебулинского района достоверно превышает аналогичный показатель в группе сравнения (п.Крапивинский).

2. Качественный спектр цитогенетических нарушений указывает на сочетанное действие химических и радиационных факторов.

3. Вероятными причинами загрязнения окружающей среды в Чебулинском районе Кемеровской области являются захоронение ядохимикатов и испытание ядерного устройства.

4. Требуется дальнейшее изучение генетических последствий загрязнения среды на территории Чебулинского района и факторов его вызывающих.

Список литературы

Ауэрбах Ш. Проблемы мутагенеза. - М.: Мир, 1978. - с. 443-444.

Беляев И.Я., Акифьев А.П. Генетические процессы и проблемы мишени в хромосомном мутагенезе. //Генетика. - 1988. Т.24. №8. с. 1384-1392.

Бочков Н.П., Демин Ю.С., Лучник Н.В. Классификация и методы учета хромосомных аберраций в соматических клетках // Генетика. 1972. Т. 8. № 5. С. 133-141.

Бочков Н.П., Чеботарев А.Н. Наследственность человека и мутагены внешней среды. М.: Медицина, 1989. 272с.

Бочков Н.П. Анализ типов аберрантных клеток - необходимый элемент биологической индикации облучения // Мед. Радиология. 1993. №2. С. 31-35.

Бочков Н.П. Генетические технологии в педиатрии. // Педиатрия. 1995. №4. С. 21-24.

Захаров А.Ф. Хромосомы человека. М: «Медицина», 1977., с.80-81

Дружинин В.Г., Лифанов А.Ю., Головина Т.А., Ульянова М.В. Цитогенетические эффекты у детей-подростков из разных районов Кемеровской области // "Генетика",1995, N7, С.983-987.

Дружинин В.Г., Лифанов А.Ю., Рытенков В.Ю. Цитогенетические нарушения у детей-подростков из Кемеровской области как индикатор экологического неблагополучия региона // "Генетика", 1997. Т.33, N5, С.699-703.

Дубинин Н.П. Потенциальные изменения в ДНК и мутации. Популярная цитогенетика. М., 1978. с. 244.

Дубинина Л.П. Лейкоциты крови человека - тест система для оценки мутагенов среды. - М.: Наука, 1977. - с. 116.

Митрофанов Ю.А., Олимпиенко Г.С. Индуцированный мутационный процесс эукариот. М., 1980. с. - 264.

Рапопорт И.А. Супермутагены. - М.: Наука, 1966. - с. 5-8.

Руководство по изучению генетических эффектов в популяциях человека. Всемирная организация здравоохранения. - Женева, - 1989 - с. 45.

Прокофьева-Бельговская А.А. Гетерохроматические районы хромосом. - М.: Наука, 1986. - с. 209.

Фогель Д. Генетика человека. М.: Мир. 1990. 384с.

Bender MA, Preston RJ, Leonard RC, Pyatt BE, Gooch PC, Shelby MD Chromosomal aberration and sister-chromatid exchange frequencies in peripheral blood lymphocytes of a large human population sample// Mutat. Res. 1988.;V.204(3):P.421-433.

Buckton K.E., Evans H.J. (Eds) Methods for the analysis of human chromosome aberrations// WHO Report. Geneva. - 1973.

Carrano A.V., Natarajan A.T. Considerations for population monitoring using cytogenetic techniques // Mutat. Res. 1988. V. 204. P.379-406.

Evans H.I. Cytogenetic and allied studies in population exposed to radiations and chemical agents // New York. 1985. P.429-451.

Ford C. E., Hamerton J. Z. 1996. The chromosomes of man. // Acta genet. et. satist. med. v. 6,2,264.

Gundy S, Varga LP. Chromosomal aberrations in healthy persons.// Mutat Res. 1983. V.120. P.187-191.

Hsy T.C., Powerat C.M. Mammalian chromosomes in vitro II A method for spreading the chromosomes of cells in tissue culture. - J. Heredity v. p. 23.

Hungerford P.A. Leukocytes cultured from small inocula of whole blood and the preparation of metaphase chromosomes by treatment with hypotonic KCl. // Stain Techn. 1965. V. 40. P. 333-338.

Tjio J.H., Levan A. The chromosome number of men. Hereditas. - 1956. - V. 42 - p.16