Материал и методы

1. Материал и методы

В работе представлены и обобщены результаты многолетних исследований лаборатории экологической токсикологии и биомониторинга СевНИИРХ ПетрГУ, проведенных в 1985-2007 г.г. с участием автора или под его руководством, а также результаты собственного анализа литературных данных по эколого-токсикологическим аспектам формирования устойчивости пресноводных экосистем к антропогенному загрязнению.

При проведении токсикологических экспериментов применяли стандартные методики [Методические рекомендации по установлению эколого-рыбохозяйственных нормативов…, 1998]. Исходя из поставленных задач, в качестве основного регистрируемого параметра во всех опытах использовали показатель смертности. Исключение составляют модельные популяции планктонных организмов, функциональное состояние которых при хроническом воздействии оценивали по показателям численности и биомассы. Биомассу ветвистоусых рачков определяли по формуле Е.В. Балушкиной и Г.Г. Винберга перерасчетом после измерения их длины тела под бинокуляром [Общие основы…, 1979].

В острых опытах, наряду с традиционным определением LT50 (время гибели 50-ти процентов подопытных в остролетальных концентрациях) и LC5024 (остролетальная концентрация реагента, вызывающая гибель 50-ти процентов подопытных за 24 часа), широко использован метод ступенчатой нагрузки. Тест-объекты в течение равных промежутков времени (1 сутки) подвергали действию концентраций веществ, возрастающих в арифметической или геометрической прогрессии при условии отсутствия отхода в опытных вариантах по сравнению с контролем и фиксировали величину LT50. Начальную концентрацию токсикантов выбирали заведомо малой, чтобы не вызывать мгновенной гибели организмов ни в одном из вариантов. Критерием устойчивости гидробионтов и токсичности реагентов служила критическая токсикологическая нагрузка, вызывающая гибель 50-ти процентов организмов в опыте (КТН50), равная сумме произведений заданных концентраций токсиканта на время экспозиции в них.

В хронических экспериментах определяли пороговую концентрацию (ПК), обусловливающую отклонение параметра от контрольного уровня на 20 % [Строганов, Колосова, 1971], максимальную недействующую концентрацию (МНДК), не вызывающую достоверных различий параметра в опыте по сравнению с контролем и расчетную величину полученной в эксперименте МНДК (LC0).

Оценку сапробности зоопланктоценозов проводили по методу Пантле и Букка, индекс видового разнообразия (ИВР) определяли по формуле Шеннона-Уивера [Макрушин,1974]. Расчет токсобности ценозов осуществляли по видовому составу руководящих комплексов, соотнесенных со шкалой токсобности организмов по ГОСТ 17.1.2.04-077.

Статистическую обработку материала проводили стандартными методами с использованием корреляционного, регрессионного и полиномиального трендового анализа [Ивантер, Коросов, 2003]. Значения LC5024 и LC0 определяли методом регрессионного и пробит-анализа, LT50 и ПК – графическим методом. Достоверность различий средних оценивали по двухвыборочному t-тесту Стьюдента с различными дисперсиями (р ≤ 0.05).

Исследования влияния факторов водной среды на устойчивость гидробионтов к интоксикации проведены в 1989-1990 г.г. в регионе Карелии, Южного Урала и Восточно-Казахстанской области (ВКО). В качестве фоновой среды в экспериментах изучена вода из 24 водоемов Южного Урала, расположенных в среднегорном лесостепном и степных районах Башкирии и Челябинской области, 24 водоемов ВКО (зона горной тайги, лесостепи и степи) и 6 водоемов Карелии (зона северной тайги).

Основным тест-объектом на Южном Урале и ВКО служили регионально представительные гаммариды (Gammarus lacustris L.) – олиготоксобный, широко распространенный вид. В Карелии использованы индикаторные и представительные для региона гидробионты: лабораторные культуры (Scenedesmus quadricauda Turp Breb, Daphnia magna Straus) и рыбы (Coregonus lavaretus L. и Salmo irideus Gib.) в период раннего онтогенеза.

В качестве тест-реагентов взяты сульфат меди, никеля, цинка и калия, нитрат свинца, нефтепродукты (солярка и бензин А-76), а также сельскохозяйственные пестициды – ДДВФ (диметилдихлорвинилфосфат) и прометрин (2-метилтио-4,6,бис (изопропиламино)- 1,3,5 сим-триазин).

О степени стабильности реагентов в водной среде судили по коэффициенту персистентности (Кп), равному отношению конечной и начальной токсичности растворов по LT50 при экспозиции 15 или 30 суток. Тестирование в Карелии проводили на дафниях, в других регионах - на гаммаридах. Изучение персистентности представляет значительный интерес для цели наших исследований, т.к. позволяет оценить в первом приближении способность фоновых сред к самоочищению.

Гидрохимические исследования в Карелии проведены лабораториями гидрохимии ИВПС КНЦ РАН и СевНИИРХ, в других регионах – ЦГХЛ соответствующих базовых предприятий цветной металлургии по стандартным методикам [Лурье, 1973]. В связи с тем, что суммарный хлорофилл достаточно точно отражает трофический статус водоема на данный период времени [Винберг, 1960], при закладке опытов определяли содержание хлорофилла а, в, и с в используемых фоновых средах. Анализ проб хлорофилла проводили в лаборатории гидрохимии ИВПС КНЦ РАН по общепринятой методике [Scor-UNESKO..., 1960].

Для расчета по уравнениям регрессии токсикометрических параметров металлов использовали значения разных уровней минерализации, содержания хлорофилла, магния и сульфатов, соответствующие средним показателям различных типов и классов озер по классификации С.П. Китаева (2007) и ГОСТ 17.1.2.04-77.

Материалом для изучения факторов устойчивости к антропогенной интоксикации водных экосистем различных природно-климатических зон служили сведения, полученные в результате обобщения и собственного анализа в зональном аспекте опубликованных данных [Борисов, 1975; Будыко, 1977; Водохранилища мира, 1979; Китаев, 1984; Пидгайко, 1984; Никаноров, Жулидов, 1991]. Для характеристики руководящих ихтиологических комплексов использовали многолетние данные по видовому составу промысловых уловов рыб во внутренних водоемах СССР [Лузанская, Савина, 1956; Озера Карелии, 1959; Смирнов, 1964; Лузанская, 1965; Ковалева, 1972; Шимановская, Чистобаева и др., 1977; Водохранилища мира, 1979; Исаев, Карпова, 1989]. Относительную ихтиомассу отдельных видов рассчитывали как процент от суммарного среднемноголетнего улова.

Анализ возрастной токсикорезистентности рыб проведен по результатам собственных многолетних исследований токсикометрии флотореагентов, компонентов буровых растворов, солей металлов и халькофильных элементов. Использованы также данные аннотационных карт разработчиков рыбохозяйственных ПДК.

Тест-объектами в опытах на рыбах служили: радужная форель (Salmo gairdneri Rich.), семга (Salmo salar L.), кижуч (Oncorhynchus kisutch Walbaum), ладожская форель (Salmo trutta morpha lacustris L.), нарвская кумжа (Salmo trutta trutta L.), пелядь (Coregonus peled Gmelin), сиг (Coregonus lavaretus L.), ряпушка (Coregonus albula L.) пелсиг (гибрид пеляди с сигом); на планктонных организмах - лабораторная культура представительного для водоемов Карелии ветвистоусого рачка Daphnia pulex Leydig. В качестве тест-реагентов использованы медный купорос, бихромат калия и гербицид Ситовит.

Закономерности сезонных изменений функционального состояния популяций гидробионтов в норме и при токсификации изучены на лабораторных культурах рыб (Poecilia reticulata Peters), водорослей (Scenedesmus quadricauda Turp. Breb., Chlorella vulgaris Beyer) и дафний (Daphnia magna Straus) и двух видах ветвистоусых рачков (Simocephalus vetulus (O. F. Mьler), Daphnia pulex Leydig), отловленных в одном и том же природном водоеме.

Исследование сезонной токсикорезистентности гуппи проводили в течение года на односуточных мальках. По окончании хронических экспериментов (экспозиция 28 сут.) у подопытных определяли интенсивность дыхания [Строганов, 1962], массу и длину тела. Эксперименты на популяциях планктонных организмов вели круглогодично при постоянной освещенности и температуре 16-190 С. Природные популяции Cladocera и московской культуры Daphnia magna, полученной в лаборатории экологической токсикологии ВНИРО, в течение месяца адаптировали к условиям содержания в аквариальной СевНИИРХ. В опытах на зоопланктонных организмах учитывали суммарную биомассу и возрастную структуру популяций, на водорослях - индекс замедленной флуоресценции (ИЗФ). Тест-реагентами служили сульфат меди и никеля.

Материалом для анализа сезонной динамики токсикорезистентности гидробионтов на ценотическом уровне послужили опубликованные данные многолетних академических исследований по лимнологии водохранилищ и озер [Мордухай-Болтовская, 1955; Деньгина, 1964; Луферова, Монаков, 1966; Андроникова, 1971; Цееб, Травянко и др., 1972; Кожов, Помазкова, 1973; Мешкова, 1973; Петрович, 1973; Вьюшкова, Белова, 1977; Ривьер, 1978; Бушман, 1982; Куликова, 1982, 1984, 1992; Лозовик, Пальшин и др., 1989], обработанные нами в соответствии с рассматриваемой проблемой.

Закономерности формирования популяционной нормы реакции на закисление водной среды изучены на лабораторных культурах зеленой водоросли Scenedesmus quadricauda (Turp.) Breb (в пяти повторностях) и ветвистоусого рачка Daphnia pulex Leydig (в двух повторностях).

Исследования популяционного адаптивного потенциала зоопланктонных организмов к токсическому воздействию металлов проведены на Daphnia pulex Leydig. С целью обеспечения достаточной генетической гетерогенности исходного материала, для формирования модельных популяций использованы "дикие" дафнии, отловленные в природном временном водоеме и адаптированные к условиям аквариального содержания в течение 2 месяцев. Тест-реагентами служили сульфат меди и нитрат свинца.

Адаптацию модельных популяций к металлам осуществляли методом ступенчатой нагрузки Перевод в новую концентрацию проводили через 30-40 суток, когда популяция достигала достаточной численности и биомассы насыщения. Часть адаптированной на данной ступени популяции оставалась в прежних условиях в течение 1 года. По окончании адаптационного периода модельные популяции, сформированные при разных уровнях содержания в воде Cu и Pb, тестировали на устойчивость к острой и хронической интоксикации соответствующим металлом. Для определения относительной токсикорезистентности адаптированных популяций каждый раз по полной схеме ставили вариант с неадаптированными дафниями, культивируемыми в течение года на фоне чистой воды (контроль). Функциональное состояние модельных популяций оценивали на 28-е сутки хронического эксперимента по численности и биомассе молоди (juvs), половозрелой части популяции (ad ) и их суммарным показателям (juv + ad).

Для дополнительной оценки изучен уровень конкурентоспособности адаптированных популяций D. pulex при совместном культивировании с лабораторной культурой ветвистоусого рачка Simocephalus vetulus O.F. Mьller. В связи с тем, что S. vetulus не был адаптирован к повышенному содержанию металлов, эксперименты проведены на фоне чистой воды. Зависимость токсикорезистентности к металлам и функционального состояния двух видов Cladocera от их содержания в моно- или поликультуре оценивали по результатам хронического эксперимента при экспозиции 28 суток. Регистрируемые параметры – суммарная биомасса и ПК металла.

Закономерности и особенности формирования региональной нормы реакции природных популяций гидробионтов изучены по результатам полевых исследований, проведенных в 1985-1990 г.г. в Карелии, в 1985 г. в Хакасии, в 1986 г. в Приморском крае, в 1987 и 1990 г.г. на Южном Урале и в 1988-1989 г.г. в Восточном Казахстане.

При выборе "маточных" водоемов исходили из того, что обследуемые популяции не должны подвергаться прямому антропогенному воздействию, а их норма реакции в достаточной степени отражать региональную устойчивость биоты. Изучена токсикорезистентность водных организмов, относящихся к трем экологическим группам: зоопланктону (дафнии, циклопы, симоцефалус), зообентосу (моллюски, гаммариды, пиявки, турбеллярии, личинки поденок, веснянок, ручейников) и нектону (рыбы), из 9 водоемов Хакасии, 19 водоемов Приморского края, 40 водоемов Южного Урала, 29 водоемов Восточного Казахстана. Приоритетным объектом были выбраны гаммариды (Gammarus lacustris L.), как олиготоксобный вид, наиболее широко представленный в водоемах всех обследованных регионов. В Карелии эксперименты ставили на фоне воды из 6 водоемов. Индикаторными и представительными гидробионтами были зеленые водоросли Scenedesmus quadricauda (Turp.) Breb, ветвистоусые рачки Daphnia magna Straus, икра и личинки рыб (Salmo irideus Gibbons, Coregonus peled (Gmelin), Coregonus lavaretus L.). Тест-реагентами служили молибденат натрия, вольфрамат натрия, сульфат меди, цинка и никеля, нитрат свинца.

При обсуждении результатов исследований использованы следующие понятия:

- представительные популяции гидробионтов - региональные популяции данного вида или экотипа (в отличие от индикаторных, не являющихся аборигенными для конкретного региона или водоема);

- маточный водоем – среда обитания представительных гидробионтов;

- пороговая концентрация надфоновая – максимальная недействующая добавка металла к его природному фоновому содержанию в водоеме; абсолютная – сумма надфоновой пороговой концентрации и природного содержания металла в водоеме;

- под природным гидрохимическим фоном водоема мы понимаем качество водных масс, ненарушенных деятельностью человека [Караушев, 1987].

При исследовании процессов ацидификации фоновой средой во всех опытах была отстоянная водопроводная вода с кислотностью, близкой к нейтральной и цветностью 35 град. В экспериментах с различной степенью гумификации использовали также воду из оз. Урозера с цветностью 9 град. и рН, близким к 7.0.

Исследуемый диапазон рН (6.5-3.0) получали добавлением к фоновой среде разбавленной (1:5, 1:10 или 1:20) серной кислоты и поддерживали на заданном уровне ежедневными сменами растворов в острых опытах и через сутки – в хронических. Измерение рН проводили в свежеприготовленных растворах и в аквариумах с тест-объектами перед сменой растворов. При анализе экспериментальных данных использовали средние за период экспозиции значения рН. Расчетные величины рН50 получали по уравнениям регрессии.

При создании среды с различной цветностью применяли гумат натрия. Для приготовления основного раствора 10 г гумата растворяли в 10 л воды и настаивали 10 суток, после чего фильтровали и готовили рабочие растворы, исходя из классификации озер по степени гумозности на основе цветности по С.П. Китаеву (1984). Цветность рабочих растворов измеряли перед каждой сменой на фотоколориметре КФК-2МП с одновременным определением рН.

Исследования видовых различий резистентности зоопланктона к закислению проводили на лабораторных культурах Daphnia magna Straus, Daphnia pulex Leydig и Simocephalus serrulatus Koch, адаптированных в течение нескольких лет к аквариальным условиям с величиной рН воды, близкой к нейтральной (в среднем 6.9).

Внутривидовые различия ацидорезистентности планктонных ракообразных изучали на трех популяциях D. pulex: ладвинская и вилговская (из природных временных водоемов с рН 6.6 и 6.95 соответственно) и лабораторная культура (ладвинская популяция, адаптированная к аквариальным условиям в течение 6 лет). В опытах на рыбах использованы эмбрионы и личинки окуня Perca fluviatilis Linne из светлых олигоацидных водоемов: Ангозеро и Петрозаводская губа Онежского озера (рН в среднем 6.54 и 6.53 соответственно) и ультраполигумозных -мезоацидных ламб (Лебяжья и Озерки), закисленных естественным путем (рН в среднем 4.55 и 4.13 соответственно). Икру окуня собирали после естественного нереста с растений и сетей.

Во всех экспериментах контролем служил вариант без добавления серной кислоты (при величине рН, близкой к нейтральной). Сравнение полученных по уравнениям регрессии расчетных параметров осуществляли по индексам выживаемости и биомассы (за 1 принимали параметры для нейтральной среды).

В опытах по изучению особенностей интоксикации металлами в условиях закисления водной среды использованы представительные для водоемов Карелии гидробионты: Daphnia pulex Leydig (молодь, взрослые), взрослые моллюски Planorbarius purpure O.F. Mьller, личинки озерного лосося Salmo salar morpha sebago Girard. Реагентами служили соединения металлов, являющихся регионально приоритетными компонентами загрязнения поверхностных вод Карелии: CuSO4*5H2O, Al2(SO4)3*18H2O, FeCl3*6H2O, ZnSO4*7H2O, Pb(NO3)2, K2Cr2O7, NiSO4*2H2O, Li2SO4*H2O, NH4VO3. Сравнение полученных по уравнениям регрессии расчетных параметров токсичности осуществляли по индексам (за 1 принимали значения параметров для нейтральной среды).

Для выявления особенностей токсичности органических поллютантов при закислении водной среды в качестве тест-объектов использованы половозрелые самки Daphnia pulex Leydig и личинки окуня Perca fluviatilis L. Тест-реагентами служили: формальдегид; нефтепродукты – бензин А-76 и дизельное топливо, пестициды – гербициды (Ситовит, Глуккор, Бетарен, Гранстар, Голтикс, Зенкор), инсектицид (Данадим-БИ-58), фунгицид и протравитель семян (Оксихом); компоненты буровых растворов – пропиленгликоль, глутаральдегид, четвертичный этосульфат аммония (продукт R 8293-E), ацетат 2 - алкил - 1 - (2 - аминоэтил) - 1Н - 4,5 - дигидроимидазола (продукт PR 4659), метилизобутилкетон (продукт R 4522), модифицированный полиакриламид (продукт EC 6029-А). Сравнение экспериментальных и расчетных данных проводили по индексам (за 1 принимали значения КТН50 для нейтральной или ультраолигогумозной среды).

В исследованиях комплексного воздействия на гидробионтов закисления водной среды и повышенной биогенной нагрузки использованы модельные популяции лабораторной культуры Daphnia pulex Leydig. Для создания фосфорной нагрузки применяли однозамещенный фосфат натрия. Концентрации фосфора в опытах задавали, исходя из градации сапробности вод в соответствии с ГОСТ 17.1.2.04-77, от олигосапробного (в контроле) до гиперсапробного класса. В связи с тем, что во всех опытах использована одна и та же вода со средним содержанием Pмин. 0.034 мг/л, в изложении результатов под концентрацией фосфора мы подразумеваем его надфоновую добавку (0.05, 0.2, 0.4 и 0.8 мгР/л). Сравнение параметров осуществляли по индексам численности и биомассы (за 1 принимали значения для нейтральной среды, либо для среды без дополнительного внесения фосфора).

Биологическая шкала распределения индикаторных видов зоопланктонных организмов по степени закисления поверхностных вод, ориентированная на водоемы северотаежной зоны, разработана на основе учета присутствия (относительной биомассы, %) в составе планктоценозов индикаторных видов, чувствительных к определенным значениям рН среды. Материалом для анализа видового состава зоопланктонных сообществ служили опубликованные данные комплексных исследований водоемов Кольского полуострова и Карелии в период летней вегетации [Филимонова, 1963; Филимонова, Юрковская, 1964, 1971; Филимонова, Козлова, 1974; Филимонова, Кутикова, 1975; Хохлова, 1970; Белоусова, Филимонова, 1973; Макарцева, 1974; Салазкин, 1976; Иголкина, 1991].

Апробация разработанной биологической школы проведена при оценке степени закисления водных экосистем региона Карелии. Для анализа ацидорезистентности зоопланктоценозов условно чистых малых водоемов южной Карелии использованы архивные материалы СевНИИРХ ПетрГУ [Выбор дополнительной группы…,1970]. Данные по состоянию сообществ зоопланктона озерно-речной системы Кенти-Кенто любезно предоставлены Л.И. Власовой - ответственным исполнителем раздела мониторинговых исследований системы реки Кенти, проводимых в 1981-1987 и в 1995-1997 г.г. ИВПС Карельского НЦ РАН. При определении уровня закисления трех районов Северного Выгозера использованы материалы, представленные в диссертации Т.П. Куликовой (1984). Количественную оценку реакции зоопланктона на закисление озерных вод осуществляли по биомассе индикаторных видов (%%) в общей биомассе руководящего комплекса.