Подальший синтез глікопептидів проводився звичайним шляхом відповідно до схеми, представленої на рис. 1. Структура глікопептидів 8p-s, 22p,r і 23p,r підтверджена 1Н ЯМР спектроскопією.
Вивчення антивірусної дії в-алкілглікозидів MDP
Моделі інфекцій людини на лабораторних тваринах, зокрема грипу, широко використовуються для вивчення антиінфекційної дії та імунотоксичних характеристик різних речовин. На кафедрі мікробіології Кримського державного медичного університету ім. С.І. Георгіївського (завідувач проф. Криворутченко Ю.Л.) було досліджено вплив на експериментальну грипозну інфекцію мишей чотирьох похідних MDP 9а-d (рис. 8).
в-Децил-MDP 9а в профілактичній схемі в дозі 2 мкг/мишу сприяв виживанню тварин, надаючи помірний протективний ефект. У дозі 20 мкг/мишу речовина прискорювала загибель тварин, але до кінця експерименту різниця в числі тварин, що вижили, в контрольній і експериментальній групі зникала. Введення речовини за терапевтичною схемою демонструвало помірний протективний ефект.
в-Додецил-MDP 9b при обох формах введення і концентраціях має імунотоксичний ефект. Профілактичне введення в-тетрадецил-MDP 9с приводило до імунотоксичної дії в обох концентраціях, а для в-гексадецил-MDP 9d порівнянна імунотоксична дія спостерігалася в концентрації 2 мкг/мишу. У вищій дозі глікозид 9d практично не впливав на летальність заражених тварин, що, напевно, було пов'язано з його практичною нерозчинністю у вказаній концентрації. Таким чином з цієї групи глікопептидів захисний ефект спостерігався тільки для в-децил-MDP 9а.
Вивчення антибактеріальної протективної дії глікозидів MDP
У Інституті морфології людини РАМН (м. Москва) під керівництвом проф. О.В. Калюжина було вивчено дія ліпофільних мурамоїлдипептидів на імунну систему в тесті стимуляції антибактеріальної резистентності у мишей при внутрішньочеревинному введенні свідомо летальної дози бактерійного збудника. Перший експеримент включав вивчення протективної дії 15 глікозидів MDP (9а-е,k-s, 16b,l) при зараженні мишей Staphylococcus aureus (рис. 9).
Всі досліджені глікозиди мурамоїлдипептиду мають захисну дію на мишей при внутрішньочеревинному введенні препаратів. Так п'ять в-алкілглікозидів MDP 9а-е в досліджуваних дозах знижували летальність практично до нуля у всіх експериментах.
Найбільша захисна дія для мурамоїлдипептидів з агліконами аліциклічної і арилаліфатичної природи спостерігалася для в-циклододецил-MDP 9l. Слід зазначити опозитний вплив доз двох ізомерних арилетилглікозидів MDP на стимуляцію антиінфекційної резистентності - для в-2-п-біфенілетил-MDP 9о активність із зменшенням кількості імуномодулятора зменшувалася, а для в-2,2-дифенілетил-MDP 9n навпаки різко зростала. в-2-(Адамантил-1)етил-MDP 9m показав помірний протективний ефект, а найменшу з цієї групи сполук імуностимулюючу активність проявив в-4-трет-бутилциклогексил-MDP 9k.
Не виявлено достовірної відмінності в імуностимулюючій дії a- і b-додецил-MDP 16b, 9b та a- і b-циклододецил-MDP 16l, 9l. Мабуть, вплив ліпофільності аглікону на протективну дію перевершує над впливом конфігурації його глікозидного центру.
Із О-в-п-алкілфенілглікозидів MDP найбільший протективний ефект показали в-п-толіл-MDP 9p і в-п-(1,1,3,3-тетраметилбутил)феніл-MDP 9s. До того ж глікозид 9s був активніше відповідних арилалкільних глікозидів мурамоїлдипептиду - в-2-п-біфенілетил-MDP 9о і в-2,2-дифенілетил-MDP 9n, що також містять 14 атомів Карбону в агліконі. Захисний ефект навіть найменш активного в цій групі сполук - в-4-трет-бутилфеніл-MDP 9r був більший, ніж у відповідного аліциклічного аналога - в-4-трет-бутилциклогексил-MDP 9k.
З огляду на те, що дослідження захисної дії першої групи глікопептидів для значної частини похідних не виявило відмінностей в діапазоні доз 2-200 мкг/мишу, другий експеримент проводили з меншими дозами і двадцятикратним кроком розбавлення (рис. 10). Дані експерименту свідчать про те, що з групи в-діалкілметилглікозидів MDP 9f-i найбільша стимуляція резистентності спостерігалася для в-(нонадецил-10)- і в-(трикозаніл-12)глікозидів MDP 9h,i в дозі 2 мкг/мишу. Для в-(ундецил-6)-MDP 9f навпаки в цій дозі стимулююча активність не виявлялася.
З метою виявлення впливу природи глікозиду спільно з S-глікозидами MDP 23p,r вивчалися відповідні О-арилглікозиди 9p,r. У разі менш ліпофільних О- і S-в-п-толілглікозидів MDP 9p і 23p не виявлено відмінностей в біологічній дії. Тоді як більш ліпофільний в-п-трет-бутилфенілтіо-MDP 23r (СlogP 4,36 у п-трет-бутилтіофенолу у порівнянні з СlogP 3,30 у п-трет-бутилфенолу) був декілька активніше свого О-аналога 9r.
Третій експеримент проводили в умовах сепсису, викликаного грамнегативними бактеріями Escherichia coli. Як і в другій серії експериментів, для того, щоб виявити відмінності в імунотропній активності досліджуваних глікозидів MDP, були використані нижчі дози препаратів в ширшому діапазоні (рис. 11).
Це тестування багато в чому контрастувало з результатами першого експерименту. Наприклад, один з найбільш активних препаратів у разі використання S. aureus в-циклододецил-MDP 9l при ураженні мишей грамнегативною інфекцією в досліджуваному діапазоні доз не мав захисної дії. Не виявлено чіткого впливу ліпофільності агліконів на протективну антиінфекційну дію для більшості сполук з вивченої групи глікозидів мурамоїлдипептиду. Можливо, це пов'язано з тим, що в умовах моделі in vivo тестовані речовини в різних дозах починають діяти в синергізмі/антагонізмі з різними бактерійними продуктами і компонентами, наприклад, ліпополісахаридом.
Суттєве зниження летальності було виявлено тільки для в-тетрадецил-MDP 9с, в-4-трет-бутилфеніл-MDP 9r і в-п-(1,1,3,3-тетраметилбутил)-феніл-MDP 9s (доза 1 мкг/мишу), а також для в-децил-MDP 9а і в-(ундецил-6)-MDP 9f (доза 20 мкг/мишу).
Результати, що отримані для аномерних пар a- і в-додецил- (16b, 9b), a- і в-(ундецил-6)- (16f, 9f) та a- і в-циклододецил- (16l, 9l) MDP, як і у разі дослідження глікозидів MDP при ураженні мишей грампозитивною бактерією, не дозволило виявити чіткого впливу ні конфігурації глікозидного центру, ні введення ліпофільних агліконів на протективну антиінфекційну дію глікозидів MDP.
Нами була зроблена спроба оцінити вплив ліпофільності аглікону глікопептидів на виживаність тварин при ураженні S. aureus у разі найменшої з досліджених доз препарату, для якої найменше вірогідні дозозалежні ефекти (рис. 12, 13).
Для більшості вивчених речовин спостерігається тенденція до зростання протективної дії із збільшенням ліпофільності агліконів. З цього ряду випадають в-децил- (9а) і в-2,2-дифенілетил- (9о) мурамоїлдипептиди, для яких в даній дозі спостерігається максимальний ефект.
Аналогічно оцінювалося і вплив ліпофільності агліконів на виживання тварин при дії глікозидів MDP 9f-i,p,r, 23p,r, які тестувалися другою групою (рис. 13). Чітка кореляція спостерігається тільки для в-діалкілметилглікозидів MDP 9f-i.
На основі результатів тестування протективної активності ліпофільних глікопептидів найбільш перспективними сполуками для проведення розширених біологічних випробувань є в-децил-, в-тетрадецил- і в-п-(1,1,3,3-тетраметилбутил)феніл-MDP.
висновки
В рамках дисертаційної роботи застосування напівемпіричних підходів до дизайну глікозидів мурамоїлдипептиду дозволило отримати нові типи модифікацій: б- і в-діалкілметил-, в-п-алкілфеніл- і в-арилтіоглікозидів MDP, а також розширити ряди похідних MDP по аномерному центру новими ліпофільними глікозидами на основі лінійних аліфатичних і аліциклічних спиртів, 2-(адамантил-1)- і арилетанолів. Дослідження стимуляції глікозидами MDP антиінфекційної резистентності у мишей дозволило виявити вплив структури аглікону глікопептидів на їх біологічну активність.
1. Показано, що з вивчених прямих методів синтезу N-ацетил-D-глюкозамінідів оксазоліновий метод є найбільш ефективним для препаративного отримання в-алкілглікозидів, а глікозилювання перацетатом б-D-глюкопиранозилхлориду в умовах міжфазного каталізу у присутності бензилтриетиламонійхлориду – для в-п-алкіларилтіоглікозидів.
2. На підставі даних спектроскопії 2D 1H ЯМР вперше встановлено, що при глікозилюванні цис-,транс-4-трет-бутилциклогексанолу оксазоліновим методом переважно утворюється транс-4-трет-бутилциклогексил-в-D-глюкозамінід.
3. Вперше показано, що збільшення ліпофільності аглікону глікозидів MDP приводить до отримання похідних MDP, що проявляють більш високі імуностимулюючі властивості. Знайдені лідери у ряду похідних MDP: в-децил-, в-додецил-, в-тетрадецил-, в-гексадецил-, в-октадецил-, в-(трикозаніл-12) -, в-циклододецил-, в-п-толіл- і в-п-(1,1,3,3-тетраметилбутил)феніл-MDP, що індукують високий протективний ефект до внутрішньочеревинного зараження мишей S. aureus, а також в-тетрадецил-, в-4-трет-бутилфеніл- і в-п-(1,1,3,3-тетраметилбутил)феніл-MDP, що стимулюють резистентність мишей до зараження Е. coli.
4. Встановлено, що конфігурація аномерного центра істотно не впливає на протективний ефект ліпофільних глікозидів MDP на відміну від амфіфільних глікозидів MDP, захисна дія яких відрізняється для б- і в-аномерів.
5. В результаті скринінга ряду ліпофільних в-алкілглікозидів мурамоїлдипептиду виявлено, що тільки в-децил-MDP проявляє чітку захисну дію відносно заражених грипом мишей.
Основний зміст роботи викладений в наступних публікаціях:
1. Земляков А.Е., Цикалова В.Н., Цикалов В.В., Чирва В.Я. Синтез b-п-алкилфенилгликозидов N-ацетилмурамоил-L-аланил-D-изоглутамина // Журн. орг. та фарм. хімії. – 2004. – Т. 2, Вип. 3(7). – С. 17–20. (Виконання синтетичного експерименту, аналіз і трактування отриманих результатів).
2. Земляков А.Е., Цикалова В.Н., Цикалов В.В., Чирва В.Я., Малыгина В.Ю., Кацев А.М., Криворутченко Ю.Л. Синтез и биологическое действие липофильных b-алкилгликозидов мурамоилдипептида // Журн. орг. та фарм. хімії. – 2005. – Т. 3, Вип. 3(11). – С. 52–57. (Виконання синтетичного експерименту, аналіз і трактування отриманих результатів).
3. Земляков А.Е., Цикалова В.Н., Цикалов В.В., Чирва В.Я., Мулик Е.Л., Калюжин О.В. Синтез и протективная активность b-гликозидов N-ацетилмурамоил-L-аланил-D-изоглутамина с агликонами алкилалициклической и арилалифатической природы // Биоорган. химия. – 2005. – Т. 31, № 6. – С. 637–644. (Виконання синтетичного експерименту, аналіз і трактування отриманих результатів).
4. Земляков А.Е., Цикалова В.Н., Цикалов В.В., Чирва В.Я., Мулик Е.Л., Калюжин О.В. Синтез и протективное антиинфекционное действие аномеров липофильных гликозидов N-ацетилмурамоил-L-аланил-D-изоглутамина // Биоорган. химия. – 2006. – Т. 32, № 4. – С. 424–431. (Виконання синтетичного експерименту, аналіз і трактування отриманих результатів).
5. Земляков А.Е., Цикалова В.Н., Цикалов В.В., Чирва В.Я., Мулик Е.Л., Кузовлев Ф.Н., Калюжин О.В., Киселевский М.В. b-Диалкилметилгликозиды N-ацетилмурамоил-L-аланил-D-изоглутамина: синтез, протективное антиинфекционное и цитотоксическое действие // Биоорган. химия. – 2008. – Т. 34, № 1. – С. 114–120. (Виконання синтетичного експерименту, аналіз і трактування отриманих результатів).
6. Земляков А.Е., Цикалова В.Н., Чирва В.Я. Синтез гликозидов мурамоилдипептида с агликонами различной природы // XX Українська конф. з органiчної хiмiї. Одеса, 20–24 вересня 2004 р. – Одеса, 2004. – Ч. 2. – С. 412. (Виконання синтетичного експерименту, аналіз і інтерпретація отриманих результатів, участь в підготовці доповіді).
7. Цикалова В.Н., Цикалов В.В., Земляков А.Е., Чирва В.Я. Синтез О- и S-b-арилгликозидов N-ацетилмурамоил-L-аланил-D-изоглутамина // Int. Symp. “Advanced science in organic chemistry”. Sudak, June 26–30, 2006. – Moscow, 2006. – Р. 186. (Виконання синтетичного експерименту, аналіз і інтерпретація отриманих результатів, участь в підготовці доповіді).
8. Земляков А.Е., Цикалова В.Н., Чирва В.Я. Синтез и протективная антиинфекционная активность липофильных гликозидов мурамоилдипептида // XXI Українська конф. з органічної хімії. Чернігів, 1–5 жовтня 2007 р. – Київ, 2007. – С. 169. (Виконання синтетичного експерименту, аналіз і інтерпретація отриманих результатів, участь в підготовці доповіді).
9. Земляков А.Е., Цикалова В.Н., Калюжин О.В., Чирва В.Я. Синтез и тестирование in vitro и in vivo О-в-алкил-, О- и S-в-арилгликозидов N-ацетилмурамоил-L-аланил-D-изоглутамина. // XVIII Менделеевский съезд по общей и прикладной химии. Москва, 23–28 сентября 2007 г. – Москва, 2007. – Т. 4. – С. 536. (Виконання синтетичного експерименту, аналіз і інтерпретація отриманих результатів, участь в підготовці доповіді).
Анотація
Цикалова В.М. Ліпофільні глікозиди мурамоїлдипептиду: синтез і антиінфекційна протективна дія. - Рукопис.
Дисертація на здобуття вченого ступеня кандидата хімічних наук за спеціальністю 02.00.10 - біоорганічна хімія. Фізико-хімічний інститут ім. А.В. Богатського НАН України, Одеса, 2008.
Дисертація присвячена синтезу нових ліпофільних глікозидів N-ацетилмурамоїл-L-аланіл-D-ізоглутаміну (мурамоїлдипептид, MDP) з різноманітною структурою аглікону, зокрема з різним типом і конфігурацією глікозидного зв'язку, а також встановленню впливу структури глікозидів MDP і їх ліпофільності на протективну антиінфекційну активність.
Здійснено синтез нових в-глікозидів MDP з первинними і вторинними симетричними аліфатичними, аліциклічними, алкілфенільними, алкілтіофенільними, 2-(адамантил-1) - і арилетильними агліконами. Отримані нові ліпофільні a-глікозіди мурамоїлдипептиду: a-додецил-, a-(ундецил-6) - і a-циклододецил-MDP.
Виявлені глікозиди MDP стимулюючі стійкість мишей до поразки грампозитивнимі (S. aureus) і грамнегативнимі (Е. coli) бактеріями. Встановлено протективний ефект в-децил-MDP відносно заражених грипом мишей.
Ключові слова: глікопептиди, мурамоїлдипептид, О- і S-глікозиди, глікозилювання, антибактеріальна і вірусна резистентність.
Анотация
Цикалова В.Н. Липофильные гликозиды мурамоилдипептида: синтез и антиинфекционное протективное действие.- Рукопись.
Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук по специальности 02.00.10 – биоорганическая химия. Физико-химический институт им. А.В. Богатского НАН Украины, Одесса, 2008.
Диссертация посвящена синтезу новых липофильных гликозидов N-ацетилмурамоил-L-аланил-D-изоглутамина (мурамоилдипептид, MDP) с различной структурой агликона, в том числе с разной природой соединительного гетероатома, и конфигурацией гликозидной связи, а также установлению влияния структуры гликозидов MDP и их липофильности на протективную антинфекционную активность.
Стартовыми соединениями в синтезе липогликопептидов послужили соответствующие перацетилированные гликозиды N-ацетилглюкозамина (GlcNAc). Дальнейшая схема включала последовательное дезацетилирование соединений по Земплену, и введение 4,6-О-изопропилиденовой защиты и алкилирование свободной С3–ОН группы L-2-бромпропионовой кислотой в диоксане в присутствии гидрида натрия. Полученные защищенные D-мурамовые кислоты конденсировали с бензиловым эфиром дипептида N-гидроксисукцинимидным методом. В гликопептидах ацетальные защиты удаляли нагреванием с 70% уксусной кислотой, а бензиловые эфиры подвергли каталитическому гидрогенолизу или в случае тиогликозидов проводили омыление сложноэфирной защиты.
В первую группу производных мурамоилдипептида вошли b-гликозиды MDP с первичными и вторичными симметричными алифатическими, алициклическими, 2-(адамантил-1)- и арилэтильными агликонами. Исходные перацетилированные b-гликозиды GlcNAc получили оксазолиновым методом с выходами 62-88% для первичных спиртов, 28-68% для вторичных алифатических спиртов и 45-81% для циклододеканола и замещенных этанолов. Строение этих гликозидов подтверждено данными 1Н ЯМР-спектроскопии.
В случае цис-,транс-4-трет-бутилциклогексанола гликозилирование проводили недостатком оксазолина. Из реакционной смеси колоночной хроматографией были выделены два продукта гликозилирования: более подвижный минорный гликозид 3j и основной компонент – гликозид 3k.
Исходя из большей реакционной способности транс-4-трет-бутилциклогексанола с экваториальным расположением гидроксильной группы для соединения 3k предложена транс-конфигурация циклогексанового цикла, а для его изомера 3j – цис-конфигурация. Предложенная конфигурация заместителей в циклогексановом фрагменте агликонов соединений 3j,k подтверждается данными спектров COSY и NOESY.
Строение гликопептидных производных подтверждалось 1Н ЯМР-спектроскопией. Идентифицированы характеристические сигналы, относящиеся к протонам агликонов, углеводного остатка и лактилдипептидного фрагмента. Спектр COSY бензилового эфира b-додецил MDP позволил более точно отнести сигналы аномерного протона и метиновых протонов лактилпептидного фрагмента.
Для выявления влияния конфигурацией гликозидной связи на биологическую активность в дополнение к соответствующим b-гликозидам мурамоилдипептида получены их a-аномеры: a-додецил-, a-(ундецил-6)- и a-циклододецил-MDP. Исходные перацетилированные a-N-ацетилглюкозаминиды были получены с выходами 34-43% взаимодействием соответствующих спиртов с a-глюкозаминилхлоридом 1 в нитрометане при температуре ~90 °С в присутствии йодида ртути(II). Структура a-гликозидов GlcNAc и синтезированных на их основе гликопептидов соответствует их спектрам 1Н ЯМР.
Третью группу липофильных гликозидов MDP составили b-алкилфенил- и b-алкилфенилтиогликозиды мурамоилдипептида. Перацетилированные b-п-толил-, b-п-трет-бутилфенил- и b-п-(1,1,3,3-тетраметилбутил)фенилгликозиды GlcNAc синтезировали с выходами 61-77% гликозилированием фенолов перацетатом a-глюкозаминилхлорида в условиях межфазного катализа в системе «1,25 н. раствор NaOH – CHCl3» при катализе BnEt3NCl. Аналогично гликозилировали п-тиокрезол. Альтернативно с выходами 78 и 52%, соответственно, b-п-толил- и b-п-трет-бутилфенилтиогликозиды GlcNAc получили при действии a-глюкозаминилхлорида на тиофенолы в присутствии избытка триэтиламина.
Было исследовано влияние на экспериментальную гриппозную инфекцию мышей четырех мурамоилдипептидов с линейными алифатическими агликонами. Из группы b-децил-, b-додецил-, b-тетрадецил- и b-гексадецил-MDP протективный эффект выявлен только для b-децил-MDP.
Было изучено воздействие липофильных мурамоилдипептидов на иммунную систему в тесте стимуляции антибактериальной резистентности у мышей при внутрибрюшинном введении заведомо летальной дозы бактериального возбудителя. Исследованы две группы гликозидов MDP на стимулирование устойчивость мышей к поражению грамположительными (S. aureus) и одна - грамотрицательными (Е. coli) бактериями.
Установлено, что наиболее высокий протективный эффект к внутрибрюшинному заражению мышей S. aureus индуцируют b-алкил-, b-(трикозанил-12)-, b-циклододецил-, b-п-толил- и b-п-(1,1,3,3-тетраметилбутил)фенилгликозиды MDP. В эксперименте с Е. coli не выявлено четкого влияния липофильности или структуры агликонов на протективное антиинфекционное действие для большинства соединений из изученной группы гликозидов мурамоилдипептида. Наиболее достоверное снижение летальности, вызванноее грамотрицательными бактериями, было выявлено для b-тетрадецил-MDP, b-4-трет-бутилфенил-MDP и b-п-(1,1,3,3-тетраметилбутил)фенил-MDP (доза 1 мкг/мышь), а также для b-децил-MDP и b-(ундецил-6)-MDP (доза 20 мкг/мышь).
Не выявлено достоверного различия в иммуностимулирующем действии a- и b-гликозидов MDP.
Для большинства изученных липогликопептидов наблюдалось увеличение иммуностимулирующего действия при возрастании липофильности агликона.
Ключевые слова: гликопептиды, мурамоилдипептид, О- и S-гликозиды, гликозилирование, антибактериальная и вирусная резистентность.
SUMMARY
Tsikalova V.N. Lipophylic glycosides of muramyldipeptide: synthesis and antiinfection protective action. – Manuscript.
Thesis for Ph.D. degree on speciality 02.00.10 – bioorganic chemistry. A.V. Bogatsky Physico-Chemical Institute of the National Academy of Sciences of Ukraine, Odessa, 2008.
Thesis devotes of synthesis of new N-acetylmuramoyl-L-alanyl-D-isoglutamine (muramyldipeptide, MDP) lipophylic glycosides with various structures of aglycone, different types, and configurations of glycoside bond, and establishments of effects of structure and lipophility of MDP glycosides on their protective antiinfection action. Synthesis of new glycosides with primary and secondary symmetrical aliphatic, alicyclic, alkylphenyl, alkylphenylthio, 2-(adamantyl-1)- and arylethyl aglycons was accomplished. New lipophilic б-glycosides of muramyldipeptide, namely a-dodecyl, a-(undecyl-6), a-cycldodecyl-MDP were derived.
Glycosides of MDP, which stimulation resistance of mouse’s in the presence of gram-positive (S. aureus) and gram-negative (Е. coli) bacterium’s, were revealed. It was founded that b-decyl-MDP have protective effect against influenza virus infection in mice.
Key words: glycopeptide, muramyldipeptide, O- and S-glycosides, glycosylation, antibacterial and antivirus resistance.
* розрахункове значення коефіцієнту розподілу н-октанол - вода, одержане за допомогою програми Chem Drow Ultra 9.0 trial version
0 комментариев