3. Очистка этанола
Абсолютный этанол готовят из 90 – 96 % этилового спирта кипячением с СаО или ВаО на водяной бане с электроподогревом с обратным холодильником до тех пор, пока точка кипения не станет 78,3 С при нормальном барометрическом давлении.
Обнаружение альдегидов: к 5 мл этанола добавляют 0,2 мл раствора калия перманганата, содержащего 200 мг в 1 л (1 : 5000), раствор не должен обесцвечиваться на протяжении 20 минут. Изменение окраски указывает на присутствие альдегидов. Пищевой спирт содержит больше альдегидов, чем гидролизный.
Способы удаления альдегидов:
1. С 2, 4 динитрофинилгидрозином. К 1 л этанола добавить 2 г гидрохлорида 2, 4 динитрофинилгидрозина и 0,5 мл концентрированной соляной кислоты, закрывают пробкой и оставляют стоять 2суток в темноте, затем перегоняют.
2. С нитратом серебра. В 100 мл горячего этанола растворяют 7 г нитрата серебра и добавляют туда 15 г едкого калия, раствор выливают в 4 л подлежащего очистке этанола. Выпадает темный осадок, который постепенно оседает на дно. Через сутки его отделяют фильтрованием, этанол перегоняют, отбрасывают первую и последнюю порции.
3.Очистка хлороформа и дихлорметана.
Для определения гормонов лучше всего использовать хлороформ марки «для наркоза», содержащий небольшое количество спирта, что делает его белее стабильным. Для очистки хлороформа других марок, а также для регенерации тех порций растворителя, которые уже один раз использовались для экстракции гормонов, их взбалтывают с концентрированной серной кислотой на протяжении 1 – 2 рабочих дней, при этом серная кислота темнеет тем скорее, чем белее загрязнен растворитель. Встряхивание проводится в темноте, удобно пользоваться магнитной мешалкой, закрывая колбу светонепроницаемым колпаком. После этого кислоту отсасывают, хлороформ промывают водой, а затем на протяжении нескольких часов концентрированным раствором аммиака, 1 н гидроксидом натрия или насыщенным раствором натрия карбоната, затем опять промывают водой и осушают безводным натрия сульфатом или натрия карбонатом. После осушения растворитель перегоняют, используя стеклянный перегонный аппарат на шлифах, нагреватель – электрический с водяной баней. Конкретный режим очистки зависит от качества исходного растворителя. Об эффективности очистки лучше всего судить, поставив холостой или калибровочный опыт.
4. Очистка эфира
Для удаления перекисей эфир взбалтывают с 10 % раствором сульфида железа (2) в 1 н серной кислоте, затем промывают водой. Проверка наличия перекисей: 200 мл эфира выпаривают, остаток растворяют в 2 мл абсолютного этанола. Из этого количества отбирают 0,2 мл, к которым добавляют 0,2 мл 2 % спиртового раствора метадинитробензола и 0,2 мл 5 н раствора едкого калия в метаноле. Окраска не должна превышать той, которая развивается при добавлении к тем же реактивам 5 мкг кристаллического кетостероида.
5. Определение содержания 17 – КС в моче по реакции с метадинитробензолом (реакция Циммермана в модификации Креховой).
Принцип метода: количественное установление содержания специфически окрашенных в фиолетовый цвет экстрагированных хромогенов, образующихся в результате реакции17 – КС с метадинитробензолом в щелочной среде.
Реактивы:
1.диэтиловый (медицинский) эфир, свободный от перекисей
2.абсолютный этанол, очищенный от альдегидов и кетонов - см выше
3.концентрированная соляная кислота, 1,19 кг/л
4.ледяная уксусная кислота
5.раствор едкого натра, 100 г/л
6.5 н. раствор едкого калия в метаноле (применяемый в качестве растворителя метанол делает реактив более устойчивым, увеличивая срок его хранения). 28 г едкого калия доводят до 100 мл метанолом, после чего раствор немедленно фильтруют (в спиртовом растворе щелочи образуются желто-окрашенные продукты, которые обусловливают высокие значения абсорбции контрольной пробы). После фильтрования раствор щелочи титруют 0,1 н. соляной кислотой с индикатором метилоранжем. Реактив хранят в темной запарафинированной склянке в холодильнике. Он годен до 1,5 мес.
7.спиртовой раствор метадинитробензола, 20 г/л.
Перед использованием проверить чистоту метадинитробензола: 400 мг реагента растворяют в 20 мл абсолютного этанола, он не должен давать окраски в течение 1 часа после прибавления к нему равного объема 3 н. раствора едкого калия. В противном случае реактив перекристаллизовывают.
Перекристаллизация метадинитробензола: 10 г его препарата растворяют в 375 мл 96 % этанола и нагревают до 40 С. К раствору доливают 50 мл 2 н. едкого натра и смесь оставляют на 5 минут. Затем ее охлаждают и прибавляют к ней при помешивании 1,25 л дистиллированной воды. Раствор фильтруют через воронку Бюхнера и промывают метадинитробензол на фильтре абсолютным этанолом (1 раз – 60 мл и 2 раза – по 40 мл). Кристаллизацию следует осуществлять очень быстро, чтобы образовывались мелкие кристаллы, т. к. большие плохо растворяются в спирте. Полученные мелкие игловидные кристаллы должны иметь указанную температуру плавления. Спиртовой раствор метадинитробензола держат в темной склянке с притертой пробкой 8.метанол 9.хлороформ («для наркоза») 10.раствор формальдегида, 400 г/л (формалин). Раствор разводят в соотношении 1 : 5 дистиллированной водой. 11.стандартныерастворы кетостероидов, получаемые из кристаллических дегидроэпи андростерона и андростерона. Стандартные растворы готовят в концентрации 100 мкг/мл , для чего 5 мг дигидроэпиандростерона или андростерона растворяют в 50 мл абсолютного этанола. Хранят в холодильнике в темной склянке с притертой пробкой, эталон устойчив в течение нескольких месяцев. Ход определения: включает в себя несколько этапов.
1 этап. Гидролиз мочи. К помещенным в коническую (на 100 мл) колбу 20 мл мочи, взятой из ее суточного количества, прибавляют 3 мл концентрированной соляной кислоты, 1 мл ледяной уксусной кислоты и 0,2 мл раствора формальдегида. Содержимое колбы перемешивают, накрывают ее воронкой и ставят в кипящую водяную баню на 15 минут. После этого колбу охлаждают под струей холодной водопроводной воды и содержимое ее переносят в делительную воронку.
2 этап. Экстракция и очистка экстракта (осуществляется в делительной воронке). Экстракцию производят диэтиловым эфиром (2 раза по 10 мл) в течение 1 – 1,5 минут. Нижний слой мочи удаляют. Эфирные экстракты объединяют, промывают тремя порциями по 10 мл раствора едкого натра (по 3 минуты). Водную, содержащую эстрогены и другие вещества кислого характера, щелочную фазу убирают и экстракт промывают 1 раз 10 мл дистиллированной воды. Воду тщательно отделяют, эфирный экстракт порциями переносят в центрифужную пробирку и выпаривают на теплой (с температурой не выше 50 С) водяной бане. Сухие экстракты (при формальдегидном способе они должны быть бесцветны) на этом этапе можно оставить до следующего дня в холодильнике.
0 комментариев