3 этап. Количественное определение по Циммерману в модификации Креховой.
К сухому остатку приливают 0,2 мл абсолютного этанола, 0,2 мл метанольного раствора едкого калия и 0,2 мл спиртового раствора метадинитробензола. Содержимое пробирки тщательно перемешивают и оставляют для развития окраски на 1 ч (в темноте!!!) при комнатной температуре. По окончании инкубации добавляют 3 мл водного раствора этанола (500 г/л) и 2 мл хлороформа, смесь энергично встряхивают. Окрашенные в фиолетовый (лиловый) цвет продукты переходят в нижний, хлороформенный слой, а продукты с неспецифической окраской – желто – коричневой или коричневой – остаются в верхнем спиртоводном слое. Через пару минут верхний слой удаляют отсасыванием (пастеровской пипеткой). Делать это нужно аккуратно, тщательно собирая капли водного слоя со стенок пробирки, не засасывать хлороформенный слой.
В хлороформенный слой добавляют 1 мл абсолютного этанола. После перемешивания интенсивность окраски раствора измеряют на фотометре с зеленым (500 – 560нм) светофильтром в кювете на на 5 мм. Результаты сравнивают с аналогичными данными контрольной пробы. Окраска стабильна в течение часа, а затем интенсивность ее снижается: через 1 ч она оказывается слабее уже на 10 – 15%. В связи с этим на одно определение допустимо брать не более 10 – 15 проб.
Приготовление контрольной пробы: в две пробирки прилить по 0,2 мл абсолютного этанола, по 0,2 мл метанольного раствора едкого калия и по 0,2 мл спиртового раствора метадинитробензола. Содержимое пробирки перемешивают и деле обрабатывают как опытную пробу.
Расчет ведут по формуле или калибровочному графику. Для получения данных к расчету по формуле параллельно опытным пробам через процедуру анализа пропускают 0,5 мл основного стандартного раствора, содержащего 50 мкг андростерона или дигидроэпиандростерона.
Для получения данных к построению калибровочного графика через все этапы анализа проводят стандартный раствор андростерона (дигдроэпиандростерона) в количестве от 0,1 до 1,0 мл основного раствора. Линейная зависимость сохраняется до концентрации стандартного раствора 100 мкг/мл (100 мг/л). Экскрецию 17 – КС с мочой рассчитывают по формуле:
Х (мг/сут) = А оп * d * 50 /А ст * 20 * 1000 = А оп * d /А ст * 400
50 – содержание (мкг) андростерона или дигидроэпиандростерона в стандартной пробе
d – диурез (мл/сут)
20 – количество взятой в опыт мочи (мл)
1000 – коэффициент перерасчета, используемый для перевода мкг в мг.
Расчет по калибровочному графику проводится с использованием формулы:
Х = С * d/ 20 * 1000
С – найденное по калибровочному графику содержание 17 – КС в пробе (мкг стандартного вещества андростерона или дегидроэпиандростерона). Для перевода полученного по формуле значения из мг в мкмоль его умножают на коэффициент 3,467.
При больших концентрациях 17 – КС в моче (свыше 100 мкг в пробе) дальнейшее исследование сводится к:
1.использование кюветы на 10 – достигается разведение мочи в 5раз
2.развести мочу физиологическим раствором
В формулу ввести поправку на разведение.
Референтные значения:
| возраст | Содержание17 – КС в моче мг/сут | Содержание 17 – КС в моче мкмоль/сут |
| Грудные дети 0 – 1 год | Менее 1,0 | Менее 3 |
| Дети 1- 10 лет | Менее 5,0 | Менее 17 |
| Подростки 11 – 14 лет | Менее 12 | Менее 42 |
| Взрослые мужчины | 5 – 23 | 17 – 80 |
| Взрослые женщины | 3 – 15 | 10 – 52 |
| Мужчины старше70 лет | 3 – 12 | 10 – 42 |
| Женщины старше 70 лет | 3 - 13 | 10 – 45 |
Максимальная величина экскреции у мужчин и женщин наблюдается в возрасте25 лет, после чего начинается ее медленное снижение. Выделение 17 – КС выше в часы бодрствования, чем в часы сна. При любых состояниях напряжения экскреция 17 – КС возрастает.
4. Клинико–диагностическое значение определения 17 – КС в моче
1.Выделение 17 – КС с мочой значительно увеличивается при:
1.интерстициально – клеточной опухоли яичка
2.арренобластоме
3.лютеоцитароной опухоли яичника
2. Выделение 17 – КС умеренно увеличивается при:
1.опухоли надпочечников
2.врожденной и приобретенной гиперплазии надпочечников
При раке коры надпочечников уровень 17 – КС в моче возрастает в 2 – 10 раз, достигая иногда 300 мг/сут. Метастазирующая раковая опухоль надпочечников – до 1000 мг /сут.
3.Выделение 17 – КС с мочой снижается при:
1.аддисоновой болезни (составляет не более 1/5 – 1/3 от нормальной величины)
2.диэнцефально – гипофизарной кахексии
3.гипофизарном карликовом росте
4.гипотериозе
5.синдроме остаточных гонад
6.анорхии
7.циррозе печени
8.нефротическом синдроме
9.истощении
Факторы, влияющие на результат исследования:
1.Искажающие результат:
1.несоблюдение требований, предъявляемых к исследованию
2.неправильное хранение контейнера
3.невозможность собрать всю мочу за время исследования
4.несвоевременная отправка мочи в лабораторию
2.Повышающие результат:
1.цефалотин
2.дигитоксин
3.мепробамат
4.напроксен
5.пенециллин
6.фенотиазин
7.АКТГ
8.кортизон ацетат
9.гидрокортизон
3.Понижающие результат:
1.хлордиазепоксид
2.глюкоза
3.меглумин
4.ампициллин
5.дексаметазон
6.эстрогены
7.пероральные контрацептивы
8.преднизолон
Библиография
1.Камышников В.С. «Клинико – биохимическая лабораторная диагностика», том 2, Минск «Интерпрессервис», 2003 г , стр 350 – 366
2.Меньшиков В.В. «Справочник. Лабораторные методы исследования в клинике», Москва «Медицина», 1987 г , стр 250 – 253
3.Елесеев Ю.Ю. «Анализы. Полный справочник», Москва «Эксмо», 2006 г стр 187 – 190.
4.Земцов В.К. «Диагностика по основным показателям лабораторных исследований», Ростов – на - Дону, «Феникс», 2008 г, стр 15 – 16
5.Баулин С.И. «Справочник медсестры – лаборантки», Ростов – на - Дону, «Феникс», 2008 г, стр 175 – 177
6.Покровский В.М. «Физиология», Москва, «Медицина», 2006г, том 3, стр 234 – 256.
0 комментариев