Виділення та характеристика білкових чинників, що зв’язують інсулін в крові людей, хворих на цукровий діабет

Інститут ендокринології та обміну речовин

ім. В.П. Комісаренка АМН України

МЕЛЬНИЧЕНКО Світлана Вітаськівна

УДК 616.379-008.64:616.153.96-07-097

Виділення та характеристика білкових чинників, що зв’язують інсулін в крові людей, хворих на цукровий діабет

 

14. 01. 14 – ендокринологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2008

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті ендокринології та обміну речовин ім. В.П. Комісаренка АМН України.

Науковий керівник: доктор медичних наук Корпачев Вадим Валерійович, Інститут ендокринології та обміну речовин ім. В.П. Комісаренка АМН України, завідувач відділу клінічної фармакології та експериментальної фармакотерапії ендокринних захворювань.

Офіційні опоненти:

доктор медичних наук, старший науковий співробітник Кравченко Віктор Іванович, Інститут ендокринології та обміну речовин ім. В.П. Комісаренка АМН України, завідувач відділу епідеміології ендокринних захворювань доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Кучмеровська Тамара Муратівна, Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, провідний науковий співробітник відділу біохімії коферментів.

Захист відбудеться “20” травня__________ 2008 р. о 13 год. на засіданні спеціалізованої вченої ради Д.26.558.01 з ендокринології в Інституті ендокринології та обміну речовин ім. В.П. Комісаренка АМН України (04114, м. Київ, вул. Вишгородська, 69)

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту ендокринології та обміну речовин ім. В.П. Комісаренка АМН України (04114, м. Київ, вул. Вишгородська, 69)

Автореферат розісланий “__3__” ____квітня_____ 2008 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

доктор біологічних наук Калинська Л.М.

Загальна характеристика роботи

 

Актуальність теми. Відомо, що існують різні за властивостями типи білків сироватки крові, які зв’язують інсулін (БЗІ) [И.С. Халилова и др., 1993; В.В. Корпачев и др., 1994; В.В. Корпачев и др., 1997; Ж.В. Іванова, 1997; F.K. Gorus et al., 1998; T. Sundsten et al., 2005]. Частина з них має альбумінову природу (синальбумін) або подібна до трансферину, але переважній групі таких білків притаманні властивості глобулінів і, в першу чергу, імуноглобулінів [Л.А. Ляпина и др., 1987; А.А. Жвирблене и др., 1988; Б.А. Кудряшов и др., 1989; M. Fuchtenbusch et al., 2000; P. Achenbach et al., 2004]. Деякі з них у комплексі з інсуліном набувають гіперантигенних властивостей і викликають утворення цілого каскаду ідіотип-антиідіотипних антитіл [R. Root-Bernstel, C. Dobbelstein, 2001]. При лікуванні хворих на цукровий діабет (ЦД) не завжди вдається досягти компенсації порушень вуглеводного обміну. Частково це можна пояснити присутністю в крові білкових чинників, які здатні блокувати дію гормону на початковому етапі специфічного зв’язування його з мембранними рецепторами, що унеможливлює адекватну регуляцію глікемії та може призводити до інсулінорезистентності [K.F. Federlin, 1993; J. Lahtela N.C. et al., 1997; N.C. Schloot et al., 1997; Y. Yamanaka et al., 1997; M. Kellerer et al., 1999; J.W. Thomas В.В., 2001; Корпачев, 2001; N. Jeandidier et al., 2002; A. Lindholm et al., 2002]. Виділення та аналіз чинників, здатних блокувати фізіологічну дію інсуліну, має важливе значення при дослідженні окремих ланок патогенезу ЦД. Роботи в цьому напрямку проводилися й раніше, але отримані результати мали фрагментарний характер, що не дає змоги зробити обґрунтовані висновки як про природу білкових чинників, які блокують інсулін, так і про вміст їх у крові [Ю.А. Ярошевский и др., 1983; Н.А. Арутюнян и др., 1985; С.К. Вельбери и др., 1987; А.А. Жвирблене и др., 1988]. Останнім часом з’явились дані про те, що в крові новонароджених дітей виявлено білки невизначеної природи, які зв’язують інсулін і не належать до глобулінової фракції [S.R. Wellik et al., 1995; U. Roll et al., 1996; J.R. Bilbao et al., 1997; B. Lindberg et al., 1999; M.S. Ronkainen, 2001].

Незважаючи на те, що найбільшу групу з зазначених білків складають імуноглобуліни, однак дослідження щодо співвідношення їх з іншими БЗІ не проводились. Для цього необхідно не тільки виділити чинники, які мають властивості зв’язуватись з інсуліном, але й визначити вміст антитіл до екзогенного (ІА) та ендогенного (ІАА) інсуліну, що входять до складу одержаних фракцій. На сьогодні вміст ІА та ІАА зазвичай визначають комерційними імуноферментними (ІФА) або радіоімунними (РІА) тест-системами. Але виявилось, що на даний момент не існує єдиного загальноприйнятого уніфікованого критерію для оцінки вмісту ІА та ІАА. Оскільки кожний розробник вибирає власний спосіб інтерпретації отриманих даних, проблема полягає в тому, що результати, одержані при використанні різних комерційних тест-систем, важко порівняти між собою; більш того: ці результати не завжди співпадають [C.J. Greenbaum et al., 1992; C. Beaufort et al., 1993; P.Y. Bingley et al., 1997; H. Naserke et al., 1999; W. Woo et al., 2000; K.N. Potter et al., 2000; P.W. Mueller et al., 2002; M. Moxness et al., 2003; D. Devendra et al., 2003;]. В Україні подібні тест-системи не виробляються. Це спонукало нас провести виділення білкових чинників, надати їм характеристику та опрацювати власний метод імуноферментного аналізу для визначення антитіл до екзогенного та ендогенного інсулінів і створити на його основі тест-систему “ІФА-АТ-інс”. Застосування такого методу матиме важливе значення при обстеженні людей, хворих на ЦД з частими спонтанними гіпоглікеміями, при визначенні індивідуальної чутливості до препаратів інсуліну, оцінки їх антигенних властивостей, а також для обстеження широкого кола населення з метою ранньої діагностики та прогнозування розвитку ЦД.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація є фрагментом планових наукових досліджень, які проводились у відділі клінічної фармакології та експериментальної фармакотерапії ендокринних захворювань Інституту ендокринології та обміну речовин ім. В.П. Комісаренка АМН України: “Вивчити ефективність нових засобів фармакотерапії цукрового діабету” (№ держреєстрації 0100U00916), “Оцінка безпечності препаратів інсуліну” (№ держреєстрації 0103U004099), “Вивчити особливості стану інсулінорезистентності та дослідити ефективність нових засобів фармакотерапії цукрового діабету” (№ держреєстрації 0104U003258), “Вивчити роль імунологічних факторів в розвитку цукрового діабету І типу з метою розробки патогенетичних схем лікування” (№ держреєстрації 0100U003757).

Мета роботи: Виділити і охарактеризувати чинники, що зв’язують інсулін в крові людей, та дослідити вміст найбільш важливого з них – ІА та ІАА в сироватках крові хворих на ЦД. Розробити метод гетерогенного твердофазного імуноферментного аналізу для виявлення ІА та ІАА і створити на його основі тест-систему “ІФА-АТ-інс”.

Завдання дослідження:

1.         Виділити білки, що зв’язують інсулін в сироватках крові донорів і хворих на ЦД людей, використовуючи поетапну афінну хроматографію, та провести аналіз отриманих фракцій методами ІФА та електрофорезу в поліакриламідному гелі.

2.         Розробити власний метод гетерогенного твердофазного імуноферментного аналізу для визначення вмісту антитіл до екзогенного та ендогенного інсулінів у сироватках крові людей.

3.         Визначити діагностичні характеристики опрацьованого імуноферментного методу (чутливість, специфічність, відтворюваність).

4.         На основі розробленого методу створити імуноферментну тест-систему “ІФА-АТ-інс” для визначення ІА та ІАА в сироватці.

5.         Провести порівняльне дослідження вмісту антитіл до ендогенного та екзогенного інсулінів у сироватках крові здорових людей та хворих на ЦД розробленим імуноферментним методом та комерційними імуноферментними та радіоімунними наборами.

Об’єкт дослідження: Білкові чинники, що зв’язують інсулін в крові людей.

Предмет дослідження: Вміст ІА та ІАА в сироватках крові здорових людей і хворих на ЦД та їх співвідношення з іншими БЗІ.

Методи дослідження: У роботі використано методи афінної хроматографії, гетерогенного твердофазного імуноферментного аналізу, радіоімунного аналізу, електрофорезу в ПААГ та статистичні.

Наукова новизна. Розроблено методичні підходи до виділення білкових чинників, здатних зв’язуватись з інсуліном в сироватках крові людей. Встановлено, що використання поетапної афінної хроматографії може бути ефективним для визначення співвідношень білків, які зв’язують інсулін, у крові хворих на ЦД, що дасть змогу диференційовано підходити до розуміння механізмів виникнення деяких випадків інсулінорезистентності. Показано, що при фракціонуванні сироваток крові здорових людей та хворих на ЦД методом поетапної афінної хроматографії виявляються аналогічні фракції БЗІ, які відрізняються кількісним вмістом білка. Встановлено, що до складу інсулінзв’язуючих білків, крім антитіл до інсуліну, входять також білки неімуноглобулінової природи. Показано, що в однакових об’ємах сироваток крові хворих на ЦД і донорів міститься не тільки різна кількість усіх БЗІ, але й різна кількість білків імуноглобулінової природи.

Практичне значення одержаних результатів: Розроблено гетерогенний твердофазний імуноферментний метод визначення ІА та ІАА в сироватках крові здорових людей та хворих на ЦД та на його основі створено імуноферментну тест-систему “ІФА-АТ-інс” (Патент № 57640 А).

Створена тест-система може бути використана для діагностування інсулінорезистентності при інсулінотерапії, а також, разом з іншими маркерами аутоімунного процесу для прогнозування виникнення ЦД у здорових осіб, які мають близьких родичів, хворих на ЦД, або людей, яких за генетичними ознаками відносять до групи ризику виникнення цього захворювання.

Запропонований спосіб поетапної хроматографії може бути використаний як для визначення співвідношень білків, що зв’язують інсулін, у крові хворих з різними ускладненнями ЦД, так і для розуміння можливої природи цих ускладнень.

Особистий внесок здобувача: Автор самостійно провела патентно-інформаційний пошук та проаналізувала значний об’єм наукової літератури за темою дисертації, визначила мету та задачі дослідження. Дисертант самостійно виконала всі біохімічні і радіоімунні дослідження, здійснила статистичну обробку одержаних результатів, узагальнила і провела науковий аналіз отриманих даних, сформулювала основні положення і висновки для наукових публікацій, виступів на конференціях і оформлення дисертації.

Деякі друковані праці за темою дисертації опубліковано у співавторстві з науковим керівником та співробітниками АТЗТ НВК „Діапроф-Мед”.

Апробація результатів дисертації. Результати дисертаційної роботи доповідались та обговорювались на: I з’їзді алергологів України (м. Київ, 2002 р.); VIII Українському біохімічному з’їзді (м. Чернівці, 2002 р.); І науково-практичній конференції молодих вчених-ендокринологів “Актуальні проблеми клінічної та експериментальної ендокринології” (м. Київ, 2002 р.); ІІ конкурсі науково-технічних проектів “Інтелектуальний потенціал молодих вчених – місту Києву” (2002 р.); науково-практичній конференції “Клінічна фармакологія ендокринних захворювань” (м. Київ, 2004 р.) та ІХ Українському біохімічному з’їзді (м. Харків, 2006 р.).

Публікації: Результати дисертації опубліковано в 6 статтях, 8 тезах та в 1 монографії (1 розділ); отримано 1 деклараційний патент на винахід.

Обсяг і структура дисертації. Дисертацію викладено на 142 сторінках друкованого тексту. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, опису матеріалів та методів дослідження, 6 розділів власних досліджень, аналізу та узагальнення результатів, висновків, практичних рекомендацій. Роботу ілюстровано 27 таблицями та 11 рисунками. Список використаних джерел включає 237 найменувань, з них 59 кирилицею та 178 латиницею.

Основний зміст роботи

Матеріали та методи дослідження. У роботі використано сироватки крові людей, хворих на ЦД-1 та ЦД-2, які проходили курс лікування у відділеннях клінічної фармакології та клінічної діабетології Інституту ендокринології та обміну речовин ім. В.П. Комісаренка, а також сироватки крові здорових людей, що були отримані в Київському міському центрі крові.

Розробленим методом ІФА досліджено вміст ІА та ІАА в сироватці крові 438 хворих на цукровий діабет типу 1 (ЦД-1), 188 хворих на цукровий діабет типу 2 (ЦД-2), яких лікували препаратами інсулінів, та 104 хворих на ЦД-2, які не отримували інсулінів, а також 194 донорів. Крім того, досліджено вміст ІА та ІАА в сироватці крові 130 дітей віком від 5 до 16 років. 35 з них входили до групи ризику захворювання на ЦД-1, 30 дітей були хворі на ЦД-1 та 65 здорових.

Для відокремлення ІА та ІАА від інших білків, що зв’язують інсулін в крові людей проводили поетапну афінну хроматографію сироваток спочатку на сорбентах з напівсинтетичним (“Hoechst”) або рекомбінантним людським інсуліном (“Eli Lilly), а потім – на сорбентах з білком А (або G). Як тверду фазу використовували АН-агарозу 4В та BrCN-сефарозу 4В. Інсуліновий сорбент з BrCN-сефарозою 4В готували за методом [Я. Туркова, 1980]. Ці дослідження проведені в “ручному” режимі та на хроматографі “BioRad” (“Biologic LP”). Отримані хроматографічні фракції досліджували методом електрофорезу в поліакриламідному гелі (ПААГ) [U. Laemmli, 1970] і визначали вміст ІА та ІАА опрацьованим методом ІФА.

Принцип розробленого методу ІФА полягає в тому, що ІА та ІАА з сироватки крові зв’язуються з інсуліном, фіксованим на полістироловому планшеті. З утвореним комплексом антиген-антитіло взаємодіє кон’югат – моноклональні антитіла (МКА) до імуноглобулінів G людини, мічені пероксидазою хрону. Після вилучення незв’язаного кон’югату в лунки планшета вносять проявник – розчин, який містить субстрат та один із хромогенів о-фенілендіамін (ОФД) або тетраметилбензидин (ТМБ). Оптичну густину (ОГ) кінцевих продуктів субстратно-ферментативної реакції визначали за допомогою ридера “Multiskan EX” (Фінляндія) у двохвильовому режимі: для ОФД – при 492 нм та 620 нм, а для ТМБ – 450 нм та 620 нм. Верхню границю норми – граничне значення (ГЗ) – визначали як середнє значення величин ОГ для сироваток практично здорових людей плюс п’ять значень середньоквадратичного відхилення. Сироватки, для яких значення ОГ перевищували показник ГЗ, визначали як позитивні. Враховуючи рекомендації ВООЗ, результати дослідів представляли також у вигляді співвідношення значень ОГ зразків сироваток до ГЗ в системі (ОГ/ГЗ).

Специфічність розробленого імуноферментного методу розраховували за формулою: С = Н / Н+ХП х 100 %, де С – специфічність, Н – кількість негативних результатів ІФА, ХП – кількість хибно-позитивних результатів ІФА [D. Schochetman, S. George, 1992].

Чутливість розробленого імуноферментного методу розраховували за формулою: Ч = П / П+ХН х 100 %, де Ч – чутливість, П – кількість позитивних результатів ІФА, ХН – кількість хибно-негативних результатів ІФА [D. Schochetman, S. George, 1992].

Коефіцієнт варіації (КВ) між результатами визначення ОГ після постановки ІФА в лунках одного планшета та між різними планшетами обчислюють за формулою: КВ = s / Х_сер. x 100 %, де s – середньоквадратичне відхилення, Х_сер. – середнє арифметичне значення ОГ всіх досліджуваних зразків [В.В. Меншиков,1997].

Тест-систему “ІФА-АТ-інс” порівнювали з комерційними наборами для визначення ІА (ІАА): імуноферментним – “Anti-insulin ORG-520” (“ORGentech”, Німеччина) та радіоімунним – “IA-AIA CIS biointernational” (Франція).

При статистичній обробці одержаних даних використано значення середньої арифметичної, стандартної похибки, середньоквадратичного відхилення. Вірогідність визначали за непараметричним методом статистики з використання критерію ч² [Бабич П.Н., 2004].

Результати досліджень, аналіз їх та узагальнення. Білки, одержані після хроматографії на колонці з інсулін-сефарозним сорбентом сироваток крові донорів і хворих на ЦД-1 та ЦД-2, досліджували методом електрофорезу в 15 % ПААГ за умов відновлення.

На рис. 1 подано типову картину електрофоретичного розподілу білків, що зв’язують інсулін в сироватці крові хворих на ЦД та донорів.

Аналіз електрофореграм дає змогу зробити висновок, що інсулін-сефарозний сорбент вилучає з сироваток крові значну кількість білків, що мають різну молекулярну масу. В результаті проведення поетапної афінної хроматографії сироваток крові хворих на ЦД та донорів показано, що кількість білкових фракцій в елюатах (як від донорських сироваток, так і від хворих на ЦД) коливається від 8 до 10. Проте, слід зазначити, що електрофоретична рухливість окремих білкових фракцій, отриманих з сироваток крові людей, хворих на ЦД, дещо відрізняється від рухомості аналогічних фракцій, виділених з сироваток крові донорів.

Для детальнішого дослідження БЗІ в сироватках крові здорових людей і хворих на ЦД застосовували поетапну афінну хроматографію таких сироваток на сорбентах з інсуліном та білком А (виділяють з Staphylococcus aureus) або білком G (отримують з Streptococcus sp.). Білки А та G мають властивість зв’язуватись з Fc-фрагментом IgG людини, тому використання останніх сорбентів спрямовано на відокремлення білків імуноглобулінової природи від інших БЗІ.

Хроматографічне фракціонування сироваток крові на афінних сорбентах з інсуліном і білком А (або G), показало, що в однакових об’ємах сироваток крові хворих на ЦД і донорів міститься не тільки різна кількість БЗІ, але й різна кількість білків імуноглобулінової природи.

Так, в одному з експериментів з 5 мл сироватки крові від 10 хворих на ЦД-1 на колонці з інсуліном (h = 3 см, d = 1 см) виділено 5,87 мг білків, що зв’язують інсулін, а при розподілі їх на сорбенті з білком А (h = 1,5 см, d = 1 см) – 1,036 мг білків імуноглобулінової природи. У другому досліді, за таких же умов, отримано 5,384 і 0,753 мг білка, відповідно. При дослідженні у такий же спосіб 5 мл сироваток крові від 10 донорів одержали 1,83 мг БЗІ, з яких на частку антиінсулінових IgG припадало лише 0,182 мг, тобто майже в 5 разів менше, ніж при виділенні обох типів досліджуваних білків з сироваток крові хворих на ЦД-1.

Цими дослідами показано, що вміст білка в окремих фракціях БЗІ, за умов однотипної постановки хроматографічних та електрофоретичних досліджень, різний, в залежності від того, одержали їх з сироваток крові здорових людей, чи з сироваток хворих на ЦД.

Подальша робота з розподілу білків сироватки крові від 65 донорів (V=100 мл) та 27 хворих на ЦД-1 (V=25 мл) зазначеним вище методом поетапної хроматографії проводилась з використанням рідинного хроматографа “BioRad”. На рис. 2 представлено профілі елюції білків, що зв’язуються з інсулін-сефарозою (пік 2 на обох графіках), та рехроматографія їх на сорбенті з білок G-сефарозою (піки 3, 4 на графіках А і В).

При хроматографічному розподілі БЗІ на сорбенті з білок G-сефарозою вдалося відокремити білки, які за молекулярною масою можуть бути окремими ланцюгами IgG (пік 4), від інших БЗІ (пік 3). Після порівняння обох графіків дійшли висновку, що розподіл білків сироваток крові здорових людей і хворих на ЦД-1 на цих сорбентах дуже схожий і відрізняється тільки кількісним вмістом білка в кожній фракції; такий результат може бути обумовлений особливостями вихідного матеріалу.

Примітки: 1. Білки, які не зв’язалися з інсуліновим сорбентом ; 2. Білки, які зв’язалися з інсуліновим сорбентом (елюати з інсулінового сорбенту);