Навигация
5.8. Аффинная хроматография
Принцип метода. Компоненты аффинного сорбента. Матрицы. Активация матриц. Спейсеры. Активированные спенсеры. Лиганды с индивидуальной специфичностью. Лиганды с групповой специфичностью. Посадка лигандов на активированные матрицы. Посадка лигандов на спейсеры с помощью конденсирующих агентов. Характер закрепления лиганда на матрице. Иммобилизация нуклеиновых кислот в качестве лигандов. Сорбенты для ковалентной хроматографии.
Выбор условий хроматографии. Выбор сорбента и характера хроматографического процесса. Выбор концентрации лиганда. Загрузка сорбента. Выбор буфера для посадки вещества. Выбор элюента и метода элюции. Биоспецифическая элюция. Проведение эксперимента. Электрофоретическая элюция. Аффинная элюция с ионообменника.
Применение аффинной хроматографии.
Аффинная ЖХВД. Аффинный электрофорез
5.9. Тонкослойная хроматография
Особенности метода. Техника ТСХ. Приготовление пластинок. Нанесение препаратов. «Проявление» пластинок (хроматографическая элюция). Обнаружение пятен или полос. Элюция вещества с пластинки.
Применение ТСХ.
6. Электрофорез
6.1. Теоретические и методические основы электрофореза
Принципы электрофореза. Электрофорез с подвижной границей. Зональный электрофорез без поддерживающей среды. Непрерывный электрофорез в тонком слое жидкости (проточный электрофорез в свободной среде). Зональный электрофорез в градиенте плотности.
Зональный электрофорез в поддерживающей среде с капиллярной структурой. Электрофорез на фильтровальной бумаге. Электрофорез на ацетате целлюлозы.
Электрофорез в колонках и блоках гранулированной поддерживающей среды.
Электрофорез в агаровом и агарозном гелях. Теория электрофореза в агаровом (агарозном) геле. Аналитический электрофорез в агаровом (агарозном) геле. Препаративный электрофорез в агаровом и агарозном гелях.
Электрофорез в крахмальных гелях.
Электрофорез в полиакриламидном геле. Теория электрофореза в полиакриламидном геле. Физико-химические свойства составных частей геля. Аналитический электрофорез в полиакриламидных гелях. Препаративный электрофорез в полиакриламидном геле
6.2. Изоэлектрическое фокусирование и изотахофорез
Изоэлектрическое фокусирование. Принцип метода. Формирование градиентов рН. Методические приемы изоэлектрического фокусирования. Трудности, связанные с разделением белков методом ИЭФ. Аналитическое и препаративное изоэлектрическое фокусирование
Изотахофорез
6.3. Обнаружение, количественное определение и характеристика
макромолекул после электрофореза
Выявление макромолекул по поглощению ультрафиолетового света и флуоресценции. Выявление разделенных при электрофорезе компонентов путем их окрашивания. Сканирование окрашенных электрофореграмм. Фотографирование электрофореграмм. Высушивание полиакриламидных гелей. Разрезание полиакриламидных гелей. Выявление радиоактивности после электрофореза.
6.4. Электрофорез белков
Поведение белков при электрофорезе. Разделение белков в соответствии с размерами молекул: определение их молекулярной массы. Двухмерный электрофорез.
Окрашивание белков на электрофореграммах. Обнаружение белков по их ферментативной активности.
6.5. Электрофорез нуклеиновых кислот и нуклеопротеидов
Электрофоретические методы разделения нуклеиновых кислот и полинуклеотидов. Электрофорез нуклеиновых кислот в агаровом и агарозном гелях. Электрофорез нуклеиновых кислот в полиакриламидных гелях. Электрофорез нуклеиновых кислот в полиакриламидно-агарозных гелях. Особые проблемы, возникающие при электрофоретическом разделении нуклеиновых кислот. Изоэлектрофокусирование нуклеиновых кислот. Обнаружение нуклеиновых кислот после электрофореза. Препаративный электрофорез нуклеиновых кислот в геле. Микрометоды электрофоретического разделения нуклеиновых кислот. Определение молекулярной массы полинуклеотидов. Электрофорез нуклеопротеидных частиц.
7. Иммунный электрофорез
Принцип метода. Реакции антиген-антитело. Иммуноэлектрофорез в агаровых или агарозных гелях. Диффузия и преципитация в геле.
Иммунофиксация. Принцип метода. Оценка метода. Область применения.
Электросинерез (встречный электрофорез, электроиммуноосмофорез). Принцип метода. Оценка метода. Область применения.
Электроиммуноанализ (электроиммунодиффузия, ракетный иммуноэлектрофорез). Принцип метода. Количественное определение антигенов. Модификации метода. Область применения. Оценка метода.
Перекрестный иммуноэлектрофорез (перекрестный электрофорез в системе - антиген-антитело). Принцип метода. Оценка метода. Область применения.
Способы усиления преципитации при электроиммуноанализе и перекрестном иммуноэлектрофорезе
8. Спектральные методы
Спектр электромагнитного излучения, его основные характеристики и способы их выражения (длина волны, частота, волновое число, поток излучения, интенсивность). Ультрафиолетовая, видимая и инфракрасная области спектра. Классификация спектроскопических методов.
Спектрофотометрический метод анализа. Сущность метода. Законы поглощения электромагнитного излучения и способы их выражения. Закон Бугера-Ламберта-Бера, его математическое выражение. Величины, характеризующие поглощение. Молярный коэффициент поглощения. Оптическая плотность. Оптимальный интервал измеряемых значений оптической плотности (кривая ошибок). Критерии соблюдения законов поглощения и оценка чувствительности фотометрической реакции. Построение калибровочного графика. Способы определения концентраций веществ. Дифференциальный метод. Спектрофотометрическое титрование. Использование спектрофотометрии в хроматографии. Фотоэлектроколориметры и спектрофотометры. Применение колориметрии и спектрофотометрии.
Флюориметрические методы анализа. Различные виды люминесценции и их классификация. Основные закономерности молекулярной фотолюминесценции. Независимость спектров люминесценции от длины волны возбуждающего света. Тушение люминесценции: температурное, концентрационное, тушение посторонними примесями. Практическое применение метода. Хемилюминисцентный анализ.
9. Методы меченых атомов
Радиоактивные изотопы, используемые в биологии. Измерение радиоактивности. Авторадиография: принцип метода, техника проведения авторадиографии, преимущества и недостатки. Сцинтилляционные счетчики излучения: принцип действия, сцинтилляторы. Счет радиоактивности на фильтрах. Введение радиоактивной метки в биологические препараты in vivo и in vitro. Радиоиммуноанализ.
10. Методы химической модификации белков и мембран
Сшивание белковых субъединиц и мембран бифункциональными агентами. Диссоциация и сборка. Фрагментация полипептидов химическими методами. Фрагментация полипептидной цепи ферментативными методами. Модификация дисульфидных связей и SH-групп. Методы химической модификация функциональных групп в белках и биомембранах.
11. Иммуноферментный анализ
Принцип иммунного анализа. Получение антител с требуемой специфичностью. Пришивание фермента к антителам. Варианты методик ИФА. Современная аппаратура.
12. Масс-спектрометрический анализ
Принцип метода. Возможности качественного и количественного анализа. Требования к исследуемым образцам. Современная аппаратура.
13. Биохимические анализаторы
Использование проточных замкнутых систем в анализе.
14. Оптимизация методов выделения и очистки биологических макромолекул и соблюдение рекомендаций
Быстрота и разрешение: временной фактор. Возможные последовательности процессов фракционирования. Стабилизация макромолекул в процессе выделения и очистки. Хранение препаратов макромолекул. Замораживание и оттаивание.
Увеличение и уменьшение масштабов операций. Воспроизведение опубликованной методики. Программирование.
Список основной литературы
1. Аффинная хроматография: Методы. Под ред. П.Дин, У.Джонсона, Ф.Мидл. М.: Мир, 1988.
2. Гекселер К., Экштайн Э. Аналитические и препаративные лабораторные методы. М.: Химия, 1994.
3. Гааль, Э., Медьеши Г., Верецкеи Л. Электрофорез в разделении биологических макромолекул. М.: Мир, 1982.
4. Дарбре А. Практическая химия белка. М.: Мир, 1989.
5. Остерман Л.А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. М.: Наука, 1985.
6. Остерман Л.А. Исследование биологических макромолекул электрофокусированием, иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами. М.: Наука, 1983.
7. Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: электрофорез и центрифугирование. М.: Наука, 1981.
8. Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. М.: МЦНМО, 2002.
9. Практикум по биохимии. Под редакцией С.Е.Северина и Г.А.Соловьёвой. М.: Издательство МГУ, 1989.
Список дополнительной литературы
1. Ригетти П. Изоэлектрическое фокусирование. М.: Мир, 1985.
2. Скоупс Р. Методы очистки белков. М.: Мир, 1985.
3. Стыскин Е.Л., Ициксон Л.Б., Брауде Е.В. Практическая высокоэффективная жидкостная хроматография. М.: Химия, 1986.
Требования к уровню освоения программы
В результате изучения данной дисциплины студент должен:
знать основные методы и методические приемы, использующиеся в современных исследованиях а области биохимии и молекулярной биологии.
уметь применять приемы работы с биологическим материалом.
владеть приемами и навыками работы с современным биохимическим оборудованием.
Перечень вопросов к экзамену
1. Общие принципы биохимического исследования. Биохимические исследования на различных уровнях организации живой материи.
2. Центрифуга, ее устройство. Скорость осаждения частиц. Константа седиментации. Дифференциальное центрифугирование. Центрифугирование в градиенте плотности. Методы получения ступенчатых и непрерывных градиентов плотности.
3. Разделение белков путем осаждения. Растворимость белков при низкой концентрации солей. Высаливание при высокой концентрации соли.
4. Осаждение белков органическими растворителями. Осаждение белков органическими полимерами и другими веществами. Осаждение вследствие избирательной денатурации. Осаждение нуклеиновых кислот.
5. Особенности различных видов живых организмов в качестве исходного материала биохимических исследований. Разрушение клеток и экстракция. Способы разрушения клеток.
6. Растворы, используемые для экстракции. Буферные растворы и специальные добавки.
7. Классификация хроматографических методов. Классификация по принципу фракционирования. Классификация по способу элюции. Классификация по расположению неподвижной фазы.
8. Элементы теории хроматографической элюции. Хроматографический процесс. Хроматографическая зона. Концепция теоретических тарелок. Кинетическая теория хроматографии. Разрешение близко мигрирующих зон. Оптимизация условий фракционирования. Градиентная элюция. Хроматография макромолекул.
9. Техника колоночной хроматографии. Хроматографические колонки. Резервуары для элюента. Смесители. Внесение препарата в колонку. Перистальтические насосы. Детекторы. Коллекторы фракций. Вспомогательное оборудование.
10. Гель-фильтрация. Общая характеристика метода. Очистка и фракционирование макромолекул методом гель-фильтрации. Определение молекулярной массы. Области применения гель-фильтрации.
11. Распределительная хроматография. Нормальнофазовая и обратнофазовая распределительная хроматография. Методические особенности обратнофазовой гидрофобной хроматографии при низком давлении.
12. Адсорбционная хроматография. Сорбенты. Особенности хроматографии на оксиаппатите.
13. Тонкослойная хроматография. Приготовление пластинок. Нанесение препарата. «Проявление» пластинок (хроматографическая элюция). Обнаружение пятен или полос. Применение ТСХ.
14. Ионообменная хроматография. Ионообменники. Элюэнт. Ионные и неионные взаимодействия вещества и сорбента. Управление силой ионного взаимодействия.Применение статической ионообменной хроматографии. Выбор условий динамической ионообменной хроматографии. Способы элюции с ионообменника.
15. Аффинная хроматография. Применение. Матрицы, их активация. Спейсеры. Активированные спейсеры. Лиганды с групповой и индивидуальной специфичностью. Посадка лигандов.
16. Принцип электрофореза. Зональный электрофорез. Теория электрофореза в ПААГ. Разделение белков в присутствии ДСН.
17. Специфические электрофоретические методы: высоковольтный, проточный, двумерный электрофорез, диск-электрофорез. Изоэлектрическое фокусирование. Изотахофорез.
18. Иммунный электрофорез. Реакции антиген-антитело. Иммуноэлектрофорез в агаровых или агарозных гелях. Диффузия и преципитация в геле. Иммунофиксация. Ракетный иммуноэлектрофорез.
19. Спектрофотометрический метод анализа. Законы поглощения электромагнитного излучения. Молярный коэффициент поглощения. Оптическая плотность. Способы определения концентраций веществ. Фотоэлектроколориметры и спектрофотометры.
20. Флюорометрические методы анализа. Различные виды люминесценции. Основные закономерности молекулярной фотолюминесценции. Практическое применение метода.
21. Методы меченых атомов. Радиоактивные изотопы, используемые в биологии. Измерение радиоактивности. Авторадиография. Введение радиоактивной метки в биологические препараты in vivo и in vitro. Радиоиммуноанализ.
22. Оптимизация методов выделения и очистки биологических макромолекул и соблюдение рекомендаций Оптимизация методов выделения и очистки биологических макромолекул и соблюдение рекомендаций.
Темы курсовых работ
1. Очистка ФМСФ-КП методом гель-фильтрации.
2. Очистка ФМСФ-КП методом ионно-обменной хроматографии.
3. Очистка ФМСФ-КП методом афинной хроматографии.
4. Современные биохимические анализаторы: обзор.
5. Ферментный электрод.
6. Время-пролетная масс-спектрометрия.
7. Жидкостная хроматография высокого давления.
8. Полимеразная цепная реакция.
9. Твердофазные ферментные реакции.
10. Множественные квадрупли в масс-спектрометрии: преимущества и недостатки.
11. Методы определения кинетико-термодинамических свойств ферментов.
12. Методы изучения мембранных компонентов.
13. Дифференциальное центрифугирование: способы и современное приборное обеспечение.
14. Использование радиоактивных меток в анализе.
Сведения о переутверждении программы на очередной учебный год и регистрации изменений
| Учебный год | Решение кафедры | Внесенные изменения | Номера листов (страниц) | ||
| заменен-ных | новых | аннули-рованных | |||
| 20__/20__ | Протокол № ____ от «____»____________20_ г. Зав. кафедрой ______________ | ||||
| 20__/20__ | Протокол № ____ от «____»____________20_ г. Зав. кафедрой ______________ | ||||
| 20__/20__ | Протокол № ____ от «____»____________20_ г. Зав. кафедрой ______________ | ||||
| 20__/20__ | Протокол № ____ от «____»____________20_ г. Зав. кафедрой _____________ _ | ||||
| 20__/20__ | Протокол № ____ от «____»____________20_ г. Зав. кафедрой ______________ | ||||
Учебная программа составлена на основании ГОС ВПО 2000 г. для специальности 020208 – «Биохимия»
Программу составил:
Похожие работы
... на основе электрофоретической мобильности и высокая специфичность иммунных антисывороток. Лекция 16. Принцип иммунного электрофореза. Иммунофиксация Электрофорез с иммунофиксацией (JFE) - это двухступенчатый процесс, использующий электрофорез протеинов на первом этапе и иммунопреципитацию на втором. При этом исследованию может быть подвергнута сыворотка крови, моча, спинномозговая или ...
... заболевания. Определение маркеров опухолей хотя и дорогой, но очень важный метод исследования, без которого в ряде случаев обойтись просто невозможно. Большинство лабораторных методов исследования требуют специального оборудования. Так, для подготовки и сохранения проб при заданной температуре, а также проведения бактериологических и серологических исследований используют термостаты, а также ...
... часто используют одновременно, что значительно расширяет возможности физиологических экспериментов. Эти системы можно комбинировать в различных вариантах. ЭЛЕКТРОДЫ В физиологических исследованиях электроды являются связующим звеном между объектом исследования и приборами. Они применяются для нанесения разряжения или регистрации (отведения) биоэлектрической активности клеток, тканей и ...
... к естественным, а также позволяет формировать требуемые начальные и текущие условия эксперимента и эффективный контроль в течение заданного промежутка времени [3, 6, 13]. Созданная нами модель водной экосистемы включает элементы концептуальной и имитационных моделей. Имитационные модели - это уменьшенные копии отдельных подсистем; концептуальные модели представляют собой блоковые схемы воздействия ...
0 комментариев