Прикладные вопросы экологической генетики

Иркутская государственная сельскохозяйственная академия

Кафедра ботаники и луговодства

Реферат по экологической генетике

Тема: Прикладные вопросы экологической генетики

Выполнила: ст-ка 3 к,2гр

Агрофакультета Сидорова Т.

Иркутск-2009 г.

Содержание

1. Возникновение потребности в биотехнологии

2. Основы клонирования, техника клонирования, клонирование ДНК

3. Развитие генетической инженерии растений

4. Генетическая трансформация растений

5. Источники генов для улучшения растений

6. Безопасность генетически модифицированных растений

Введение

В связи с «вершинным» положением генетики среди биологических дисциплин она определяет развитие не только новых, как, например, биотехнологии, но и таких фундаментальных как эволюция. В связи с этим возникают новые, «частные генетики», например «лесная генетика».

В настоящее время в научных кругах обсуждается вопрос о формировании экологической генетики. Ядром экологической экологии должны стать вопросы регуляции: 1.На уровне организм- среда; 2. Средовой индукции генной активности; 3.Популяционного уровня; 4.Ценотического уровня. Во второй половине XX столетия биология вступила в свой «Золотой век». За время, прошедшее от открытия структуры ДНК в 1953г. До появившейся не так давно возможности расшифровать генетический код человека, на стыке генетики и молекулярной биологии сформировалась новая могущественная отрасль науки - биотехнология. Ее значение отражает хотя бы тот факт, что в США именно на биотехнологию расходуется почти половина средств, выделяемых на академические исследования. Биотехнология находит применение промышленности, медицине, сельском хозяйстве и многих других областях. Ее достижения могут быть направлены на благо людей, но могут принести человечеству и неисчислимые беды. Стой проблемой столкнулись физики, когда с открытием строения атома появилась возможность использовать ядерную энергию, как в мирных, так и в разрушительных целях. Френсис Крик и Морис Уилкинс, которые вместе с Джеймсом Уотсоном получили Нобелевскую премию за расшифровку структуры ДНК, были физиками, и до того как занялись биологией, работали над созданием оружия. Накопленный опыт заставил эти ученых очень внимательно относиться к этическим аспектам своих исследований. Вот почему, когда в конце 70-х гг. появились сомнения в этичности и безопасности генной инженерии, Крик и Уилкинс приостановили свою работу. Мы - будущие биологи и тоже когда-нибудь будем нести ответственность за решения, принятые в ходе обсуждения новых спорных вопросов, которые непременно будут возникать по мере углубления наших познаний в области молекулярной генетики. Чем большей информацией мы владеем, вырабатывая собственную точку зрения, и чем больше людей готово обсуждать эти проблемы, тем с большей вероятностью принятые нами решения окажутся правильными.

1.         Возникновение потребности в биотехнологии, примеры

Биотехнология – это использование организмов, биологических систем или биологических процессов в промышленном производстве. В биотехнологии применяются не только микроорганизмы. Фактически, любое производство, в основе которого лежит биологический процесс, можно рассматривать как биотехнологию. Сюда же можно включить генную инженерию и клонирование сельскохозяйственных растений и животных. Примеры биотехнологий приведены на рисунке 12.1

Биотехнология позволяет не только получать важные продукты для человека продукты, например этиловый спирт, пиво или гормон инсулин. Примерами биотехнологий являются также очистка сточных труб, переработка твердых отходов и выявление загрязнения с использованием биосенсоров. Более широко биотехнологию можно определить как использование живых организмов для нужд человека. Таким образом, к биотехнологии в принципе можно отнести разведение и усовершенствование сельскохозяйственных животных, например крупного рогатого скота и свиней, а также растений, таких как пшеница или картофель. Для этих целей особенно важны новые методы генной инженерии, поскольку они позволяют гораздо точнее и быстрее наделять живые организмы новыми желаемыми признаками по сравнению с традиционными методами селекции.

2. Основы клонирования, техника клонирования, клонирование ДНК

Основные методы инженерии были разработаны вначале 70-х гг. Суть этих методов - введение в организм нового гена. Такой ген может быть синтезирован заново, а может быть перенесен из другого организма. Если в геном бактерии встроить ген, кодирующий какой-либо белок, бактериальная клетка превращается в живую фабрику по производству этого белка. В качестве примера рассмотрим перенос в клетку и генов, кодирующих инсулин человека и гормон роста человека.

Получить копию любого гена в настоящее время задача совсем нетрудная. В некоторых заведениях для этого требуется всего одна исходная копия. Получение множества идентичных копий называют клонированием. В качестве клонирующего вектора (т.е. переносчика ДНК, которую нужно клонировать) традиционно используют плазмиды или бактериофаги. Плазмиды – это небольшие кольцевые фрагменты ДНК, обнаруженные в некоторых бактериях. Они отделены от основной (хромосомной) ДНК, и могут реплицироваться независимо от нее. Бактериофаги (или, для краткости, фаги)- это вирусы, которые могут вводить свою ДНК в бактериальную клетку, эта ДНК реплицируется. Фрагменты ДНК, которые необходимо клонировать, соединяют либо с плазмидной, либо с фаговой ДНК. Полученная «конструкция», состоящая из ДНК-фрагментов различных организмов, называется рекомбинантной ДНК. Если такую ДНК ввести в бактериальную клетку, то с каждым циклом деления увеличивается и число копий рекомбинантной ДНК. Встроенный в бактериальный геном чужеродный ген может использоваться для получения в промышленных количествах полезного белка, например такого, как инсулин человека, который в норме не производится бактериальной клеткой.

Генную инженерию бактерий можно подразделить на пять этапов.

Этап 1. Выделение копии нужного гена из всех остальных генов организма.

Этап 2. Встраивание нужного гена в вектор.

Этап 3. Использование вектора для введения нужного гена в репициентную клетку.

Этап 4. Отбор клеток, в которые вошла чужеродная ДНК (донорная ДНК).

Этап 5. Клонирование гена

Приведенная выше очередность этапов - самая простая. Однако в некоторых случаях порядок действий может быть иным; например, в вектор может быть встроена и клонирована целая группа генов и лишь затем выделен нужный ген.

Этап 1. Получение копии нужного гена.

Это самая трудная часть процесса. Например, в геноме человека (геном это вся ДНК в клетке) насчитывается около 3млрд. нулеотидов и ≈ 100 000 генов. Типичный ген имеет несколько тысяч пар нуклеотидов в длину, так что даже найти конкрентный ген не так просто. Для получения копии гена используют три метода:

1)         С помощью обратной траскриптазы получат копию гена на матрице его мРНК;

2)         Синтезируют искусственный ген.

3)         Используют метод «дробовика» («shotgun»), вклющающий разрезание ДНК рестрикционными ферментами (рестриктазами)и поиск фрагмента, содержащего нужный ген.

Метод «дробовика» - использование рестрикционных ферментов.

Этот первый метод выделения генов был разработан в конце 1960-х начале 1970-х гг. его появление стало возможным благодаря открытию ферментов, называемых рестрикционными (от англ. Restricting- ограничивающий) эндонуклеазами или рестриктазами. Эти ферменты обнаруженные в бактериях, способны разрезать ДНК, например они разрезают любую вторгающуюся в бактериальную клетку вирусную ДНК, ограничивая таким образом размножение вирусов внутри клетки. Разные виды бактерий продуцируют различные рестрекционные эндонулеазы. Кажда из них разрезает нуклеоновую кислоту (отсюда «нуклеаза») в строго определенных точках («эндо» означает, что фермент разрезает молекулу изнутри, а не атакует ее с концов). Фермент распознает некую последовательность оснований и взаимодействий именно с ней. Точки разрезания называются сайтами рестрикции. К настоящему времени выделено более 2000 рестриктаз, активных в отношении 230 разных последовательностей. Свою собственную ДНК бактерия защищает путем присоединения к определенным основаниям в сайтах рестрикции метильной группы.

Название каждого фермента происходит от названия бактерии, из которой его выделяют. Рестрицируемая последовательность - мишень часто имеет шесть оснований в длину и является палиндромной, т.е. читается одинаково в обоих направлениях. Две комплементарные цепи ДНК считываются в противоположных направлениях. Некоторые рестриктазы производят ступенчатые надрезы. В результате их действия образуются фрагменты ДНК с выступающими одноцепочечными концами. Такие концы называются «липкими»; их используют для воссоединения фрагментов ДНК. Они как бы слипаются за счет образования водородных связей с комплементарными липкими концами других молекул ДНК, разрезанных той же рестриктазой.

При обработке ДНК донорного организма рестриктазами рассчитывают на то, что один из фрагментов будет случайным образом содержать полную копию нужного гена и ничего больше.

Этап 2. Встраивание генов в вектор

Плазмидная ДНК

Кольцевые молекулы плазмидной ДНК у бактерий гораздо меньше, чем основная хромосомная ДНК, поэтому их можно легко отделить друг от друга. Бактериальные клетки разрушают и центрифугируют. При этом хромосомная ДНК оказывается в осадке, а плазмидная ДНК остается в жидкой фазе над осадком. Перед обработкой рестриктазами плазмидную ДНК очищают.

Фаговый вектор

Преимуществом фагов как векторов является возможность клонирования больших фрагментов ДНК по сравнению с теми, которые могут переносить плазмиды. Чаще других для этой цели используют фаг λ. Часть фаговой ДНК заменяют на ДНК, которую нужно клонировать. Эта часть не нужна для репликации фаговой ДНК в бактериальной клетке-хозяине, поэтому клонирование не нарушается.

Этап 3.Введение вектора в хозяйскую клетку

На данном этапе фаговый или плазмидный вектор вводят в бактериальную клетку, в которой он сможет размножаться (клонировать себя и чужеродную донорную ДНК, которую он содержит). Как правило, для этих целей используют бактерию Escherichia coli- обычного обитателя кишечника человека. Кишечная палочка выбрана для этой цели потому, что генетика этой бактерии хорошо изучена, а также потому, что она быстро растет (время удвоения составляет около 30 мин). Для генной инженерии получен специальный мутант E.coli, выживающий только в особых лабораторных условиях. Поэтому он не способен заразить человека, если случайно попадает в окружающую среду вместе с чужеродными генами, которые он содержит.

При использовании плазмидного вектора препарат плазмиды добавляют в пробирку, содержащую культуру E.coli. Туда же вносят ионы кальция (обычно в виде хлорида кальция) и клетки подвергают короткому тепловому шоку. В результате в клеточной мембране E.coli быстро образуются поры, через которые плазмиды проникают внутрь клетки. Процесс введения новой ДНК в бактериальную клетку называется трансформацией.

Этап 4. Клонирование ДНК

Одна-единственная фаговая частица, содержащая рекомбинатную молекулу ДНК, может менее чем за один день образовать более 10¹² идентичных копий самой себя и этой молекулы. Клетки E.coli, содержащие плазмиды, обычно высевают на питательный агар в чашки Петри. Здесь клетки делятся каждые 30 мин, со временем образуя видимые колонии. При этом появляется такое же число копий требуемой ДНК, как и при использовании фаговых векторов, и к тому же при делении бактерий в них синтезируются сотни копий плазмиды. С помощью этих двух способов за короткое время получают миллиарды клонов. Теперь прежде чем проводить дальнейшее клонирование, нужно провести отбор трансформационных бактерий.

3.Развитие генетической инженерии растений

Традиционные методы селекции, основанные, главным образом, на половой гибридизации и отборе, позволяют получать новые генотипы растений. Они обеспечивают получение огромного числа сортов и гибридов сельскохозяйственных культур, в том числе шедевров селекции. Выдающиеся селекционеры России (Лукьяненко, Пустовойт, Ремесло, Гаркавый, Кириченко, Калиненко и др.) внесли решающий вклад в эти достижения. Классические методы селекции и в дальнейшем будут составлять основу получения новых сортов. Генно-инженерные манипуляции позволяют решать ряд важных задач по повышению устойчивости новых форм, линий, сортов и гибридов сельскохозяйственных растений к патогенам и сокращению продолжительности выведения новых сортов.

Технология рекомбинантных ДНК позволяет выделять гены как прокариотического, так и эукариотического происжождения, переносит этот ген (или несколько генов) в хромосомы реципиентного растения обеспечивать его экспрессию. Применение этой технологии делает поиск более целенаправленным и значительно расширяет возможности манипулирования генетическим аппаратом.

Важным преимуществом растений по сравнению с животными является возможность получения целого растения из одной клетки, основанная на свойстве тотипотентности. Результаты генетической инженерии растений во многом зависят от разработки методов культуры тканей, особенно методик регенерации различных растений.

Технология генетической инженерии состоит из следующих основных этапов получения трансгенных растений: 1) выбор гена и его клонирование; 2) подбор генотипа растения -реципиента; 3) введение гена и его экспрессия в геноме растения-реципиента; 4)регенерация трансформированных клеток и отбор трансгенных растений.