Свободно-радикальные процессы при экспериментальной ишемии головного мозга

ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ОБРАЗОВАНИЮ

Пензенский государственный педагогический университет

имени В. Г. Белинского

 

Факультет  Кафедра

Естественно-географический

Биохимии

ДИПЛОМНАЯ РАБОТА НА ТЕМУ:

Свободно-радикальные процессы

при экспериментальной ишемии головного мозга

Студент________________________________________Заварзина В. А.

Руководитель___________________________________Фирстова Н. В.

____________________Левашова О. А.

К защите допустить. Протокол № от «_____» ____________2008 г.

Зав. кафедрой ____________________________________Генгин М. Т.

Пенза, 2008 год

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1.   Этиология и патогенез ишемии мозга

1.2.   Свободно-радикальное окисление и антиоксидантная защита при патологии головного мозга

1.2.1. Свободно-радикальное окисление: общие сведения

1.2.2. Продукты перекисного окисления липидов (диеновые коньюгаты, ТБК-реактанты, шиффовы основания)

1.2.3. Процессы свободно-радикального окисления липидов в развитии и течении острых нарушений мозгового кровообращения

1.2.3.1.     Малоновый диальдегид (МДА) как интегральный показатель процессов свободно-радикального окисления

1.2.3.2.     Биохемилюминесценция как метод оценки состояния свободно-радикальных процессов при ишемическом инсульте мозга

1.2.4. Антиоксидантная система: контроль за процессами перекисного окисления липидов при ишемии мозга

1.3. Модели ишемии

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Материалы исследования

2.2. Методы исследования

2.2.1. Моделирование неполной ишемии у крыс

2.2.2. Метод определения концентрации малонового диальдегида в сыворотке крови

2.2.3. Метод люминолзависимой хемилюминисценции в цельной крови

2.3. Статистическая обработка результатов исследования

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1. Свободнорадикальные процессы при ишемическом инсульте

3.2. Исследование активности хемилюминесценции цельной крови и концентрации МДА в сыворотке крови при экспериментальной ишемии головного мозга

3.2.1 Показатели свободнорадикального окисления при моделировании ишемии головного мозга

3.2.1.1. Исследование динамики ТБК-активных продуктов при моделировании ишемии головного мозга

3.2.1.2. Исследование динамики показателей хемилюминесценции при моделировании ишемии

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ

ВЫВОДЫ

ЛИТЕРАТУРА

ПРИЛОЖЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АО – антиоксидантная система

АОЗ – антиоксидантная защита

АФК – активные формы кислорода

ДК – диеновые конъюгаты

DAG – диацилглицерол

ЛХЛМ – люминолзависимая хемилюминесценция

МДА – малоновый диальдегид

НК – нуклеиновые кислоты

ОНМК – острая недостаточность (нарушения) мозгового кровообращения

ПОЛ – перекисное окисление липидов

СМА – средняя мозговая артерия

СОД – супероксиддисмутаза

СР – свободные радикалы

СРБ – С-реактивный белок

СРО – свободно-радикальное окисление

ТБК – тиобарбитуровая кислота

ХМЛ – хемилюминесценция

ВВЕДЕНИЕ

 

В последние годы новейшие достижения в биохимии создали необходимые предпосылки для успеха в смежных областях и в первую очередь в медицине. В этой связи неизмеримо возросло значение патологической биохимии как отрасли науки, изучающей молекулярные основы различных форм болезней.

 К наиболее распространенным заболеваниям зрелого‚ пожилого, а в последние десятилетия и молодого возраста относятся острые нарушения мозгового кровообращения (ОНМК). Летальность в острый период инсульта достигает 35 %, увеличиваясь почти на 15 % к концу первого года заболевания. Соотношение геморрагических и ишемических нарушений мозгового кровообращения составляет 1:4-5. Риск повторного инсульта оценивается в 8-20 %. Постинсультная инвалидизация занимает первое место среди всех возможных причин утраты трудоспособности, к прежней работе возвращаются лишь около 20 % лиц, перенесших инсульт, при этом одна треть больных - люди социально активного возраста [52]. В последние десять лет в России ежегодно регистрируется около 400000 инсультов, из них чаще (70-80 %) встречаются ишемические инсульты, более редко (20-30 % и 5 % соответственно) кровоизлияние в мозг и субарахноидальное кровоизлияние [19]. Исследования последних лет доказали, что гибель нервной ткани при ишемии происходит в результате каскада патобиохимических и патофизиологических процессов [20, 21].

Активация свободнорадикальных процессов при ишемии мозга приводит к развитию оксидантного стресса, являющегося одним из универсальных механизмов повреждения тканей. В связи с этим представляет интерес исследование процессов свободнорадикального окисления (СРО) в крови.

Современным методом для изучения интенсивности свободно-радикальных процессов, в частности перекисного окисления липидов (ПОЛ) является регистрация индуцированной биохемилюминесценции биологических объектов. Этот метод применяется для диагностики нарушений липидного обмена, воспалительных, инфекционных и онкологических заболеваний. В клинических условиях хемилюминесцентный показатель может быть применен для определения остроты процесса, степени тяжести по динамике значений хемилюминесценции.

Интенсивность процессов ПОЛ может быть‚ в частности‚ исследована при определении количества образующегося при физиологических и патологических процессах вторичного продукта ПОЛ – малонового диальдегида [57]. Увеличение концентрации малонового диальдегида является свидетельством усиления ПОЛ и срыва антиоксидантной защиты [2].

Известно, что решению медико-социальных проблем, возникающих в связи с распространенностью инсульта, способствует изучение механизмов заболевания на различных экспериментальных моделях [65].

Целью нашей работы было исследование процессов свободно-радикального окисления в цельной крови и сыворотке на экспериментальной модели неполной ишемии головного мозга крыс.

При выполнении данной работы были поставлены следующие задачи:

1. Провести исследование концентрации ТБК-АП (МДА) в сыворотке крови при окклюзионном повреждении мозга в динамике экспериментальной острой ишемии мозга (модель неполной ишемии).

2. Провести исследование концентрации ТБК-АП (МДА) в сыворотке крови при реперфузионном повреждении мозга в динамике экспериментальной острой ишемии мозга (модель неполной ишемии).

3. Провести исследование показателей хемилюминесценции цельной крови при окклюзионном повреждении мозга в динамике экспериментальной острой ишемии мозга (модель неполной ишемии).

4. Провести исследование показателей хемилюминесценции цельной крови при реперфузионном повреждении мозга в динамике экспериментальной острой ишемии мозга (модель неполной ишемии).

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

 

1.1. Этиология и патогенез ишемии мозга

Острые нарушения мозгового кровообращения – наиболее распространенные заболевания головного мозга в зрелом и пожилом возрасте. Преобладающими нарушениями церебрального кровотока является очаговая ишемия мозга, которая развивается в 4 раза чаще, чем кровоизлияние в мозг [8, 14, 20, 51, 68]. Ишемия представляет собой ухудшение (неполная) или полное прекращение (тотальная) всех трех функций локального кровоснабжения: доставки кислорода в ткань, доставки пластических веществ – субстратов окисления и удаление продуктов метаболизма [3].

Развитие ишемического инсульта, является наиболее серьезным осложнением ишемической болезни мозга. Среди этиологических факторов наибольшее значение имеют атеросклероз и гипертоническая болезнь как наиболее значимые сосудистые заболеваниям. Не следует забывать об экстравазальных компрессиях, особенно компрессиях позвоночных артерий в области шеи при дегенеративных изменениях в позвоночнике. В результате компрессий возникает редукция мозгового кровотока, которая вызывает развитие последующей ишемии мозга. Среди основных причин кардиогенных эмболий – мерцательная аритмия различной этиологии, инфаркт миокарда и его последствия, эндокардит, кардиомиопатия. Эти факторы наиболее угрожаемы для развития инсульта и именно мерцательная аритмия является самым значимым фактором риска развития ишемического инсульта [61].

Исследования последних лет позволили по-новому взглянуть на динамику процессов повреждения нервной ткани при церебральной ишемии, которая подразумевает каскадность метаболических изменений [20, 31]. На ранней стадии ишемии повреждение мозгового вещества может быть обратимым, что подчеркивает важность и необходимость комплексных исследований биохимических процессов.

В настоящее время выделяют 4 патогенетических варианта
ишемического инсульта: атеротромбический, эмболический, гемодинамический и микроциркуляторный. Атеротромбический инсульт составляет примерно 20-30 % и вызван тромбозом, развивающимся обычно на месте атеросклеротической бляшки. Прецеребральные артерии (позвоночные, сонные), крупные и средние церебральные артерии поражаются атероматозными бляшками. Увеличение атеротромботической бляшки может привести к сужению просвета артерии и её полной закупорке. Снижение кровотока возникает при гемодинамически значимом стенозе – сужении просвета сосудов до 70-75%.

Эмболический инсульт является причиной 20-25 % ишемических инсультов и чаще обусловлен кардиогенной эмболией (кардиоэмболический инсульт) или эмболией из аорты и крупных вне- или внутричерепных артерий (артерио-артериальная эмболия).

Лакунарные инсульты, обусловленные поражением мелких внутримозговых сосудов, часто вследствие артериальной гипертензии, составляют 20-25 % всех острых церебральных ишемий. Значительно меньший удельный вес имеет инсульт, развивающийся по механизму гемореологической окклюзии [8, 9, 14, 32, 68].

Многолетнее изучение механизмов формирования острой недостаточности мозгового кровообращения позволило выделить 4 группы основных патогенетических факторов [5, 7, 17, 18, 66].

1) морфологические изменения сосудов, кровоснабжающих головной мозг (окклюзирующие поражения, аномалии развития и т.д.);

2)        расстройства общей и церебральной гемодинамики, которые способствуют снижению кровотока до критического уровня с формированием сосудисто-мозговой недостаточности;

3)        изменение физико-химических свойств крови, в частности, её свёртываемости, агрегации форменных элементов, вязкости, других реологических свойств:

4)        индивидуальные и возрастные особенности метаболизма мозга, вариабельность которых обусловливает различия реакций на локальное ограничение мозгового кровотока.

Независимо от причины, которая привела к ишемии мозга, развивается каскад патобиохимических изменений, которые в итоге завершаются повреждением нервной ткани по механизмам некроза и апоптоза.

Одним из важных механизмов в запуске указанного каскада является снижение мозгового кровотока. В норме, когда оптимальный объём мозгового кровотока составляет 50-60 мл/100 г/мин, мозг получает необходимую энергию в результате окисления глюкозы и образования АТФ, причём окисление одной молекулы глюкозы даёт 38 молекул АТФ. При ишемии вследствие недостатка кислорода возникает анаэробный путь расщепления глюкозы, и из одной её молекулы образуется только 2 молекулы АТФ.

При снижении уровня кровотока менее 55-50 мл на 100 г в 1 мин возникает первый критический уровень в виде торможения белкового синтеза. Дальнейшее снижение кровотока, до 35 мл на 100 г в 1 мин – второй критический уровень – приводит к активации анаэробного гликолиза и увеличению концентрации лактата, развитию лактат-ацидоза и тканевого цитотоксического отёка. Продолжающееся снижение кровотока до 20 мл на 100 г в 1 мин – третий критический уровень – приводит к снижению синтеза АТФ, формированию энергетической недостаточности, к дисфункции каналов активного ионного транспорта (выходу К⁺ из клетки и перемещению Na⁺ и Са²⁺ в клетку), дестабилизации клеточных мембран и избыточному выбросу возбуждающих нейромедиаторов – глутамата и аспартата (возникает так называемая "глутаматная эксайтотоксичность"). Перевозбуждение НМДА-рецепторов (N-метил-Д-аспартат) приводит к раскрытию новых кальциевых каналов, вследствие чего обеспечивается дополнительный приток Са²⁺ в нейроны. Когда мозговой кровоток достигает 20% от нормальной величины (10-15 мл на 100 г в 1 мин), развивается аноксическая деполяризация мембран, которая считается главным критерием необратимого поражения клеток [20, 51].

В развитии каскада патобиохимических и патофизиологических
процессов выделяют три основные этапа: индукции (запуск), амплификации (усиление повреждающего потенциала) и экспрессии (конечные реакции каскада) [20].

Этап индукции. Дефицит макроэргических субстратов в мозге приводит к «обесточиванию» Na⁺- K⁺ - АТФ-азной ферментной системы, которая управляет энергозависимым ионным транспортом. Нарушение активного ионного транспорта обусловливает пассивный отток К⁺ из клеток, приток Са²⁺, что приводит к деполяризации клеточных мембран. Внутриклеточное накопление ионов Са²⁺ при мозговой ишемии вызывает перегрузку митохондрий с разобщением окислительного фосфорилирования и усилением катаболических процессов; оно сопровождается переходом Са²⁺ в активную форму посредством соединения с внутриклеточным рецептором кальмодулином, что ведёт к активации кальмодулинзависимых протеинкиназ, липаз и эндонуклеаз, фрагментации дезоксирибонуклеиновых кислот (ДНК), гибели клетки [21].

Таким образом, уже на самых начальных этапах патобиохимического каскада, запущенного дефицитом макроэргов, начинается процесс внутриклеточного накопления кальция, являющийся одним из ключевых механизмов запуска как некротической, так и программированной смерти нейрона [21].

Важным путём поступления кальция в клетку являются агонистзависимые кальциевые каналы, особенно те, которые контролируются рецепторами, активирующимися возбуждающими аминоацидергическими медиаторами – глутаматом и аспартатом. Повышение их включает компенсаторные механизмы: обратный захват нейронами и астроцитами избытков из межклеточного пространства, пресинаптическое торможение выброса медиаторов, метаболическую утилизацию и др. Однако в условиях ишемии нарушается высокоселективная система транспорта глутамата и аспартата из синаптической щели в астроглию за счёт дисфункции каналов активного ионного транспорта и астроцитоза, изменяется система путей преобразования медиаторов; это приводит к тому, что абсолютная концентрация и время пребывания глутамата и аспартата в синаптической щели превышают допустимые пределы, и процесс деполяризации мембран нейронов приобретает необратимый характер [21].

Этап амплификации связан с продолжающимся увеличением внутриклеточной концентрации ионов кальция. Нарастание внутриклеточной концентрации кальция в сочетании с повышением содержания диацилглицерола (DAG) изменяет активность ферментов, модифицирующих мембранные белки, в том числе и глутаматные рецепторы. В результате увеличивается чувствительность нейронов к возбуждающим сигналам. Замыкается «порочный круг»: повышенная возбудимость может способствовать дальнейшему накоплению кальция и усилению выделения глутамата из нервных окончаний. Согласно экспериментальным данным, в областях мозга с плотно прилегающими нейронами, содержащими глутаматные рецепторы, одна массивно деполяризованная клетка индуцирует такое высвобождение глутамата, что возбуждает соседние нейроны. В результате вступает в силу «механизм домино» – последовательное распространение метаболических нарушений от нейрона к нейрону. Таким образом, события, происходящие на этапе амплификации, не только увеличивают накопление кальция, но и усугубляют токсичное возбуждение окружающих нейронов [21].

Этап амплификации создаёт условия для третьего этапа – экспрессии, на котором происходят необратимые изменения, приводящие к клеточной смерти. Механизмы, непосредственно повреждающие нейроны и глию, изучены наиболее полно [21].

Избыточное внутриклеточное накопление ионов Са²⁺ активирует внутриклеточные энзимы: липазы, протеазы, эндонуклеазы и запускает каскадный механизм ферментативных реакций, приводящих к катаболическому повреждению нейрона. Особенно разрушителен распад фосфолипидов в наружной клеточной мембране и в мембранах внутриклеточных органелл [21].

Таким образом‚ схема последовательных этапов «ишемического каскада» на основе причинно-следственных связей может иметь вид:

1)      снижение мозгового кровотока;

2)      глутаматная «эксайтотоксичность»;

3)     внутриклеточное накопление ионов кальция;

4)     активация внутриклеточных ферментов;

5)     повышение синтеза оксида азота и развитие оксидантного стресса;

6)     экспрессия генов раннего реагирования;

7)     отдаленные последствия ишемии (реакции местного воспаления,
микрососудистые нарушения, повреждения гематоэнцефалического
барьера);

8)     апоптоз [45].

Ведущим патогенетическим механизмом ишемической смерти нейронов является избыточная активация глутаматных рецепторов. При этом происходящие в мозге эксайтотоксические процессы неразрывно связаны с параллельно протекающими реакциями образования оксида азота, свободнорадикального окисления, воспаления.