Объекты и методы исследований

2. Объекты и методы исследований

  2.1 Объекты исследований

В качестве объектов исследования были выбраны различные виды микроскопических грибов рода Aspergillus: A. niger, A. ustus, A. terreus, A. flavus, A. fumigatus. Культуры были взяты из коллекции культур микроорганизмов кафедры «Прикладная биология и микробиология» АГТУ. Данные виды микромицетов были выделены из основных типов почв Астраханской области.

В качестве источника углерода были выбраны из легкоусвояемых – сахара: сахароза, арабиноза, ксилоза, галактоза, лактоза и мальтоза; многоатомные спирты: глицерин, сорбит, маннит; а также из полисахаридов – крахмал. Все эти источники были взяты из коллекции химических реактивов кафедры. Из трудноразлагаемых источников углерода были использованы: нефть, целлюлоза, гербицид и пестицид. Целлюлозу добавляли в среду в виде мелко нарезанной фильтровальной бумаги. Для определения способности микроскопических грибов рода Aspergillus использовать в качестве единственного источника углерода гербициды в данной работе использовали гербицид «Пиримифос-метил» или О, О-диметил-О – (2-диэтиламино-6-метилпиримидил-4) тиофосфат – это жидкость соломенного цвета, практически не растворим в воде, хорошо растворим во многих органических растворителях, неустойчив в кислой и щелочной средах, является эффективным средством для борьбы со многими насекомыми и клещами. Для определения способности микромицетов рода Aspergillus использовать пестициды в качестве источника углерода применяли дуст. Сахара, крахмал и многоатомные спирты добавлялись в среды в количестве 30 г./л, нефть – 30 мл/л, целлюлоза – 10 г./л, гербицид – 0,25 мл/л и пестицид – 0,001 г./л.

2.2 Принципы составления питательных сред для грибов. Основные принципы композиции сред

При составлении питательных сред для грибов обычно пользуются результатами предварительных исследований по выяснению значения для роста и развития изучаемого объекта концентрации отдельных компонентов (источников углерода, азота, зольных веществ и витаминов).

Основными правилами, которых придерживаются при составлении сред, способствующих росту грибов, являются следующие:

1)         целесообразно применять отдельные источники углерода и азота;

2)         концентрация вещества, служащего источником азотного питания, должна сильно уступать концентрации вещества – источника углерода (примерно в 10 – 15 раз).

Хотя среды натурального происхождения более благоприятны для роста большинства грибов, однако при физиологических экспериментах по изучению развития и обмена у грибов использовать их нежелательно, так как их состав непостоянен. Для этих экспериментов обычно используются синтетические среды. Одной из первых синтетических сред для грибов (культур видов аспергиллов и пенициллов) была среда Роллена следующего состава (г/л):

сахароза – 72 (около 5%);

винная кислота – 4 (для подкисления среды);

фосфорнокислый аммоний – 4;

углекислый калий – 0,6;

сернокислый аммоний – 0,25;

сернокислый цинк – 0,07;

сернокислое железо – 0,07;

кремнекислый калий – 0,07;

дистиллированная вода – 1500 мл.

Более простой состав имеет среда Чапека (г/л):

сахароза – 30;

NaNO₃ – 2;

MgSO₄ – 0,5;

FeSO₄ – 0,01;

KH₂PO₄ – 1;

KCl – 0,5;

дистиллированная вода – 1000 мл.

Для многих грибов среды являются неполноценными. Некоторые грибы (особенно витаминозависимые) растут на них плохо или совсем не растут. В таких случаях, если потребность данного организма в витаминах не изучена, необходимо добавлять в среду экстракты растительных или животных тканей, выбирая их исходя из экологии данного гриба. Например, в среды для выращивания грибов – дереворазрушителей добавляют опилки из древесины той породы дерева, которую они поражают в природе, для выращивания грибов – паразитов растений – ткани растения – хозяина; выращивание грибов – копрофилов производится на средах с навозным экстрактом (Беккер, 1983).

2.3 Приготовление питательных сред

Посуда для приготовления сред не должна содержать посторонних веществ, например щелочей, выделяемых некоторыми сортами стекла. Перед употреблением посуду тщательно мыли, полоскали и высушивали. Среды варили в стеклянных колбах объемом 250 мл. Каждой среды готовили объемом по 100 мл, рассчитанной на 5 культур исследуемых штаммов. После варки среды стерилизовали в автоклаве при 0,5 атм. и 120 ^○С в течение 20 минут. После стерилизации и добавления соответствующих источников углеродного питания среды разливали в стерильные чашки Петри по 20 мл. Предварительно в чашки вносят по 1 капле молочной кислоты для подкисления среды, которое необходимо, чтобы убить бактерии.

2.4 Определение способности плесневых грибов использовать соединения углерода

Микромицеты характеризуются неодинаковой способностью использовать различные соединения углерода для конструктивного и энергетического метаболизма. Чтобы выяснить возможность роста гриба за счет тех или иных углеродсодержащих веществ, их высевают на синтетические среды, содержащие в качестве единственного источника углерода различные моно-, ди- и полисахариды, многоатомные спирты, органические кислоты, углеводороды.

В данной работе определение особенностей роста грибов на различных источниках углеродного питания проводилось путем поверхностного посева исследуемых штаммов на среду Чапека с различными источниками углерода и среду Частухина (для целлюлозоразрушающих грибов). Посев культур осуществляли уколом в центр чашки Петри. Время культивирования составляло 14 суток, температура культивирования – 25±2 ^○С. Значение применяемых питательных сред для процессов роста грибов оценивалось методом измерения радиальной скорости роста путем периодического замера диаметра колоний грибов (через каждые 48 часов), растущих на чашках Петри.

Для определения способности микромицетов использовать различные источники углерода применяют и другие методики.

Например, многие микромицеты могут использовать в качестве единственного источника углерода органические кислоты. Для определения способности расти на средах с органическими кислотами рекомендуется плотная среда состава (г/л): (NH₄)₂HPO₄ – 0,5; MgSO₄*7H₂O – 0,2; NaCl – 0,1; агар – 15,0; органическая кислота в виде соли Na или К – 2,0; pH 6,8. До стерилизации к среде добавляют 20 мл 0,04% водного раствора индикатора метилрот, который в интервале pH 6,8 – 8,4 изменяет окраску от желтой к красной. Среду разливают в пробирки и стерилизуют при 1 атм. Посев проводят уколом. Продолжительность культивирования от 2 до 14 суток в зависимости от скорости роста микроорганизмов. О потреблении органических кислот свидетельствует рост по уколу и изменение кислотности среды в щелочную сторону, что отчетливо заметно по цвету индикатора.

Некоторые грибы способны использовать и такие химически устойчивые соединения, как углеводороды. Выявить способность микроорганизма окислять жидкие нелетучие углеводороды можно на плотной среде состава (г/л): KNO₃ – 4,0; KH₂PO₄ – 0,6; Na₂HPO₄*12H₂O – 1,4; MgSO₄*7H₂O – 0,8; выщелоченный агар – 2,0; pH 7,2. Среду стерилизуют в колбах при 1 атм. и разливают в чашки Петри толстым слоем. После того как среда застынет, в центре агаровой пластинки вырезают лунку. Для этой цели можно воспользоваться пробочным сверлом (диаметр 8–10 мм), которое предварительно стерилизуют в пламени горелки. Микромицеты высевают радиальными штрихами от лунки к периферии чашки. В лунку вносят 2–3 капли исследуемого углеводорода (стерилизуют фильтрованием). Чашки помещают в термостат строго горизонтально, не переворачивая. Через 7–10 суток отмечают наличие или отсутствие роста по штриху в сравнении с контролем – ростом на среде без углеводорода (Нетрусов, 2005).