Ультрацентрифугирование

2. Ультрацентрифугирование

10-20 лет тому назад скоростные ультрацентрифуги составляли едва ли не главную часть приборного оснащения любой биохимической лаборатории. Сейчас, когда молекулярная биология перешла на работу с микроколичествами исходных материалов, эти дорогие и капризные машины заняли куда более скромное место в арсенале исследователей. Тем не менее, в некоторых случаях, когда предполагается начать обширную программу изучения какого-нибудь однородного биологического материала, имеет смысл воспользоваться возможностями ультрацентрифугирования. Поэтому в этой главе мы весьма кратко познакомимся с этими возможностями.

2.1 Ультрацентрифуга

Этим термином принято называть центрифуги, позволяющие достигать скорости вращения своих роторов вплоть до 80 тысяч оборотов в минуту. На радиусе ротора в 6 см это создает в радиальном направлении ускорение в 700 тысяч раз превышающее ускорение земного притяжения («700 000 g»). Препарат ДНК с массой в 0,5 микрограмма, который фигурировал в предыдущей главе, при такой скорости вращения испытывал бы силу, влекущую его к периферии ротора, эквивалентную весу в 350 миллиграмм. А это — уже весьма ощутимая величина.

Вращение с такой скоростью невозможно осуществить в нормальной атмосфере из-за катастрофического разогрева ротора. Поэтому главным элементом конструкции ультрацентрифуги является вакуумная камера, в которой вращается ротор. Используя последовательное подключение к камере диффузионного масляного и обычного форвакуумного насосов, в ней удается достигнуть разрежения в 10-³ мм ртутного столба. Отсюда возникают технические трудности с обеспечением герметичности камеры — как по окружности ее довольно большой крышки, так и по оси мотора, вращающего ротор, поскольку этот мотор, естественно, располагается вне камеры. Столь же надежно должны быть герметизированы съемными колпачками и пробирки, устанавливаемые в ротор. В противном случае находящаяся в них жидкость закипит и улетучится.

Несмотря на столь высокий вакуум, роторы при такой огромной скорости вращения все же нагреваются, и потому их приходится охлаждать (через инфракрасное излучение) путем контролируемого интенсивного охлаждения стенок камеры. Что тоже составляет проблему, поскольку камера изготавливается из брони, толщиной в 2—3 см. Ее назначение — защитить оператора в случае разрыва ротора центробежными силами. Такое случается, если в материале ротора есть скрытый дефект. Или при слишком длительном использовании ротора, у которого есть предельный срок службы, определяемый «усталостью» материала. Высокоскоростные роторы изготавливаются из титана, низкоскоростные — из дюралюминия.

Ультрацентрифуги комплектуются, по выбору покупателя, набором разнообразных роторов: на большие скорости вращения и малые объемы пробирок, или наоборот, — на большие объемы и относительно малые скорости. Объемы пробирок варьируют в широких пределах: от 6,5 до 94-х миллилитров.

Используются (в основном) роторы двух типов: угловые и со свободно подвешенными (откидывающимися) пробирками. Второй тип роторов часто называют «бакет-роторами». Эти роторы несут три или шесть пробирок, которые устанавливают в свободно подвешенные металлические гильзы — «бакеты» (от английского bucket — ведро). Пробирки герметизируются крышками, навинчивающимися через прокладки на бакеты. Последние сначала висят вертикально, опираясь на гибкую ось. Но уже на малых скоростях вращения бакеты откидываются до горизонтального положения, ось прогибается, а они своими полу сферическими наружными краями опираются на соответствующие гнезда в самом роторе — так, что центробежная сила передается не на подвеску, а на само массивное тело ротора.

В угловых роторах (рис.1) гнезда для пробирок выполнены в самом теле ротора. Размеры гнезд и угол их наклона варьируют в широких пределах. Число гнезд всегда четное.

Рис. 1

Перед установкой в ротор заполненные пробирки вместе с еще не установленными на них колпачками попарно уравновешиваются (добавлением жидкости) весьма тщательно. В противном случае неизбежны опасные биения ротора при вращении. То же самое относится к бакет-роторами с шестью пробирками. В случае трех пробирок все они, вместе с бакетами и их крышками должны иметь совершенно одинаковый вес. Для каждого типа роторов указывается максимально допустимая скорость вращения.

К этой технической части описания ультрацентрифуги остается добавить, что все рабочие параметры процесса центрифугирования: скорость и продолжительность вращения, температура ротора и даже степень плавности его остановки задаются предварительно и далее обеспечиваются автоматически контрольными устройствами самого прибора.

В бакет-роторах частицы, оседающие под действием центробежной силы, движутся вдоль оси пробирки и оседают на ее сферическое дно. В угловых роторах частицы движутся сначала горизонтально в направлении наиболее удаленной от оси вращения стенки пробирки, затем по ней соскальзывают вниз и собираются в самой дальней части пробирки — в месте перехода от ее цилиндрической стенки к сферическому дну.

Литература

1.  Микаэлян Н.П., Князев Ю.А. Основные стороны патогенеза гипергликемического синдрома при экстремальных состояниях. // Бюллетень эксперимент. биологии и медицины. - 1994. -N 1. -С. 22-26.

2.  Михайленко А.А., Покровский В.И. Отек-набухание головного мозга при коматозных состояниях у инфекционных больных. - М.- Медицина. -1997.

3.  Мороз В.В., Молчанова Л.В., Щербакова Л.Н. и др. Показатели липидного обмена у больных в критических состояниях //Анест. и реанимат. -2001.- №6.-С..4-7.

4.  Мусил Я. Основы биохимии патологических процессов. - М., -1985. -С.356-361