Группа пневмовирусов

Курсовая работа

на тему:

"Группа пневмовирусов"

Содержание

1. Уникальные особенности пневмовирусов

1.1 Общее введение

1.2 Номенклатура

1.3 Выделение вируса

1.4 Хранение вируса

2. Основные методы

2.1 Культивирование респираторно-синцитиального вируса

2.1.1 Чувствительные культуры клеток

2.1.2 Цитопатогенное действие

2.1.3 Методы повышения инфекционное ™

2.1.4 Методы стабилизации инфекционное

2.2 Методы определения инфекционности

2.3 Гемагглютинация

2.4 Гемадсорбция

2.5 Иммунофлуоресцентные методы

2.6 Твердофазный иммуноферментный анализ

3. Аналитические методы

3.1 Радиоактивное лечение, радиоиммуноанализ и радиоиммунопреципитация

3.1.1 Введение радиоактивной метки в вирусные белки в зараженных РСВ клетках

3.1.2 Радиоиммуноанализ

3.1.3 Радиоиммунопреципитация

3.2 Метод выявления дефектных интерферирующих частиц

3.3 Электронная микроскопия

3.3.1 Морфология вирионов

3.3.2 Морфогенез вирионов

3.3.3 Сканирующая электронная микроскопия

3.3.4 Локализация и количественное определение вирусных антигенов по связыванию стафилококков

3.4 Концентрирование вируса

3.5 Очистка и радиоактивное мечение РСВ

3.5.1 Градиентное центрифугирование

3.5.2 Очистка РСВ методом изопикнического центрифугирования

3.6 Радиоактивное мечение вирионной РНК

3.7 Анализ вирусных РНК и белков методом электрофореза в полиакриламидном геле

3.7.1 Анализ белков

3.7.2 Анализ РНК

3.8 Очистка матричной РНК для трансляции

3.9 Молекулярное клонирование и олигонуклеотидное секвенирование

3.10 Очистка вирусных белков

3.10.1 Вирусные полипептиды

3.10.2 Очистка капсидного белка

3.10.3 Очистка вирионных гликопротеинов

4. Специальные биологические методы

4.1 Получение моноклональных антител

4.2 Выделение температурно-чувствительных мутантов

4.3 Получение персистентно инфицированных клеточных культур

1. Уникальные особенности пневмовирусов 1.1 Общее введение

В состав группы пневмовирусов входят респираторно-синцитиальный вирус человека, респираторно-синцитиальный вирус крупного рогатого скота и вирус пневмонии мышей. Прототип этой группы, респираторно-синцитиальный вирус, - это плеоморфный оболочечный вирус, геном которого представлен несегментированной РНК негативной полярности. РСВ принадлежит роду Pneumovirus, который вместе с родами Paramyxovirus и Morbillivirus образует семейство Paramyxoviridae. Однозначно доказана этиологическая роль РСВ при ежегодных вспышках респираторных заболеваний у детей. Уникальность биологических, биохимических и клинических характеристик этого вируса не позволяет объединить его с представителями рода Paramyxovirus. РСВ обнаруживают у сельскохозяйственных животных; РСВ крупного рогатого скота вызывает у животных респираторное заболевание. Антитела к РСВ часто присутствуют и в сыворотке крови других домашних и лабораторных животных, контактирующих с человеком, но выделение вируса от этих животных не описано. Изоляты РСВ, выделенные от человека и крупного рогатого скота, имеют антигенное родство; среди человеческих изолятов не обнаружена связь между антигенной вариабельностью и клиникой заболеваний. Вирус пневмонии мышей, вызывающий у этих животных респираторное заболевание, не имеет антигенного родства с РСВ, однако в некоторой степени сходен с ним; во всяком случае это единственный вирус, достаточно близкий к РСВ, чтобы быть включенным в род Pneumovirus. Антитела к ВПМ с высокой частотой обнаруживаются в сыворотке крови человека; имеются неопубликованные данные, указывающие на то, что в лабораторные колонии мышей этот вирус попал от человека.

Основные свойства РСВ приведены в табл.1. РСВ отличается от других парамиксовирусов большим числом идентифицированных белков, порядком генов (имеются два гена неструктурных белков, один из которых расположен между З'-концевой лидерной последовательностью и геном нуклеопротеина, а другой - между гипотетическими генами гликопротеинов F и G), отсутствием гемагглютинина и нейраминидазы, а также характерными размерами нуклеокапсида и поверхностных выступов.

Таблица 1. Общие свойства пневмовирусов

Известные представители рода Нуклеиновая кислота Белки'> Вирионные ферменты Плавучая плотность частиц Морфология частиц Морфология нуклеокапсида Морфология мембранных выростов Генетические взаимодействия Стабильность Круг хозяев Патогенность Цитопатогенность

РСВ человека РСВ крупного рогатого скота Вирус пневмонии мышей Однонитевая несегментированная РНК с коэффициентом седиментации 50S; мол. масса >5 - 10е 2 гликопротеина оболочки: гликопротеин G мол. масса 90 кД и связанные между собой дисульфидными связями продукты расщепления гликопротеина F 2 негликозилированных белка оболочки: белок матрикса мол. масса 26 кД и белок с неизвестной функцией мол. масса 24 кД 3 белка сердцевины: гипотетическая полимераза, нуклеокапсидный белок и фосфопротеин 3 неструктурных белка неизвестной функции РНК-полимеразная активность Гемагглютинин Нейраминидазная активность отсутствует 1.15-1,26 г/см3 Плеоморфные частицы диаметром 80^ - 500 нм и нитевидные частицы диаметром 60-ПО нм и длиной до 5 мкм. Спиральный тип симметрии, диаметр 12 - 13 нм Длина 10-12 нм 8 групп комплементации Рекомбинация или множественная реактивация не обнаружены Термолабильны, нестабильны при рН<3,0, чувствительны к замораживанию и оттаиванию In vivo, вероятно, ограничен Ассоциированы преимущественно с респираторными заболеваниями и спорадически с другими патологическими состояниями Образуют цитоплазматические, реже ядерные включения, часто формируют синцитии. Имеют склонность к персистенции

1.2 Номенклатура

В англоязычной литературе для обозначения респираторно-синцитиального вируса имеет смысл использовать сокращение RS-вирус, а не RSV, чтобы отличать его от вируса саркомы Рауса, типичного представителя ретровирусов. Кроме того, респираторно-синцитиальный вирус крупного рогатого скота следует отличать от не родственного ему синцитий-образующего вируса, также относящегося к ретровирусам.

1.3 Выделение вируса

В связи с необычной лабильностью РСВ и низким титром в секретах и зараженных тканях при выделении этого вируса требуется особая тщательность. Попытки выделения вируса из хранившихся образцов редко бывают успешными. Имеет смысл доставлять чувствительную культуру клеток непосредственно к месту нахождения пациента или зараженного животного, а не транспортировать содержащие вирус материалы в лабораторию для заражения культуры.

Чаще всего для выделения РСВ используют линии клеток Нер-2 и HeLa, однако описано использование культуры почек макак-резусов, линий BS-C-I, MRC-5, WI-38 и некоторых других. Лучшим материалом для выделения РСВ служат смывы слизистой носа или носоглотки больных детей. Смывы можно перенести в пробирку с небольшим количеством буферного раствора или бульона. Содержимое пробирок перемешивают энергичным встряхиванием. Образцы следует держать в ледяной бане и как можно скорее использовать для заражения чувствительной культуры клеток. Во всяком случае, промежуток между сбором материала и заражением культуры не должен превышать нескольких часов. Из антибиотиков наиболее часто используют пенициллин ', стрептомицин, неомицин и микостатин.

Для успешного выделения РСВ важно избегать замораживания и оттаивания образцов, при их хранении поддерживать достаточно низкую температуру, как можно быстрее использовать материал для заражения чувствительной культуры и включать в состав культуральной среды ЭТС или БСА. Сыворотка взрослых домашних животных, обычно используемая для культивирования клеток, как правило, содержит достаточно высокий титр нейтрализующих РСВ антител; поэтому ее нельзя использовать при выделении этого вируса. Зараженную культуру инкубируют при 36-37 °С и наблюдают за ней не менее 3 нед, регулярно меняя среду. Для выявления ЦПД могут потребоваться дополнительные слепые пассажи. Для РСВ характерно ЦПД в виде образования синцития, но этот эффект наблюдается не всегда, и его проявление зависит от штамма вируса и типа зараженной культуры.

1.4 Хранение вируса

Пневмовирусы следует хранить в интервале температур от -70°С до - 198°С. При - 20°С наступает достаточно быстрая потеря инфекционное™, и в таких условиях вирус нельзя хранить более 3 мес. Лиофилизация или добавление глицерина позволяют увеличить срок хранения вируса при - 20°С. Быстрота падения инфекционности зависит от природы содержащего вирус материала; так, вирус, связанный с мембранами, более стабилен, чем свободный.

2. Основные методы 2.1 Культивирование респираторно-синцитиального вируса 2.1.1 Чувствительные культуры клеток

Имеется большой набор клеточных линий, чувствительных к РСВ. В диагностических лабораториях чаще всего используют линию гетероплоидных клеток человека Нер-2, поскольку ее легко поддерживать.

Тем не менее для выделения РСВ более подходят диплоидные линии клеток человека, например эмбриональных клеток легких WI-38, HeL-1, L-4, L-49, HLDC-1, - 4, - 6 и эмбриональных клеток мозга НВС-1 и НВС-4.

РСВ размножается и в разнообразных культурах клеток животных, в частности в клетках почек кошек, норок и кенгуровой крысы. Степень чувствительности разных линий клеток, по-видимому, зависит от схемы пассирования используемого штамма вируса. Например, после трех пассажей через, индивидуальные бляшки на культуре клеток WI-38 полученный изолят вируса давал на этих клетках в 50 раз более высокий титр, чем вирус, пассируемый на клетках BS-C-1.

РСВ может быть адаптирован и к росту в некоторых первичных культурах клеток холоднокровных животных, например черепахи Testudo graced, но он не размножается в клетках земноводных и беспозвоночных, в частности комаров. В отличие от многих других парамиксовирусов РСВ не размножается в куриных эмбрионах и культуре клеток куриного эмбриона. Кроме того, в отличие от вируса пневмонии мышей он не размножается в клетках ВНК-21.

При серийном пассировании РСВ с высокой частотой образуются дефектные интерферирующие частицы. Разработан простой колориметрический метод обнаружения и количественного определения ДИЧ,

Для размножения РСВ в культуре клеток можно использовать основную минимальную среду Игла, желательно с дополнительными аминокислотами. Лучший выход вируса, как правило, дают активно делящиеся клетки. Можно использовать и другие среды, например среду Лейбовича, для поддержания рН которой не требуется газообразная СОг. Температура размножения РСВ составляет 25-39 °С; максимальный выход получают при температуре около 37°С.

2.1.2 Цитопатогенное действие

Характерное для РСВ цитопатогенное действие - это образование синцития. В синцитиях ядра клеток часто образуют агрегаты, окружающие центральную полость. Однако формирование синцития наблюдается далеко не всегда; характер ЦПД определяется многими факторами, в том числе штаммом вируса, условиями культивирования и типом клеток. Например, при заражении клеток почек африканской зеленой мартышки образуются фокусы агрегированных клеток. Под агаровым покрытием они выглядят как интенсивно окрашенные сгустки клеток, напоминающие фокусы трансформации, индуцируемые онкогенными вирусами. Однако индуцируемые РСВ фокусы окружены слабо окрашенной областью (рис.2). Ее образование обусловлено миграцией клеток к формирующемуся скоплению. Фокусы состоят из увеличившихся в размерах разбухших клеток, которые затем дают начало синцитию. Несмотря на внешнее сходство фокусов, индуцируемых онкогенными вирусами и РСВ, клетки последних не сохраняют способность к делению.

2.1.3 Методы повышения инфекционное ™

Обработка вируса или клеток ДЭАЭ-декстраном повышает чувствительность клеток к РСВ. При оптимальной концентрации, равной 40 мкг/мл, ДЭАЭ-декстран в 2 раза повышает выход вируса; имеются данные и о том, что число клеток, зараженных РСВ крупного рогатого скота, возрастает в этих условиях в 11 раз. Нисевич и др. сообщили о 100-кратном увеличении числа клеток, зараженных РСВ человека, в присутствии 15 мкг/мл ДЭАЭ-декстрана.

2.1.4 Методы стабилизации инфекционное

Инфекционность РСВ стабилизируется в присутствии высоких концентраций сахарозы или ионов магния. Ферни и Герин сообщили, что в присутствии 1 М MgS04 стабильность РСВ возросла в 30 раз и период полужизни инфекционного вируса при 4°С увеличился до 12 нед. Добавление MgS04 до концентрации 1 М облегчает очистку РСВ для физико-химических исследований, однако при выделении вируса и определении его инфекционной активности добавление MgS04 нежелательно, поскольку высокая ионная сила оказывает отрицательное воздействие на культуры клеток.

2.2 Методы определения инфекционности

Инфекционность препаратов РСВ можно определить методом бляшек. Метод, описываемый здесь для клеток BS-C-1, пригоден и для работы с большинством других клеточных культур.

1. Высевают по 10⁶ клеток в чашки Петри диаметром 60 мм. Чашки инкубируют в течение ночи при 37 °С и используют клетки сразу же после образования плотного монослоя.

2. Культуральную среду удаляют и вносят в чашки по 0,2 мл последовательных 10-кратных разведений вирусного препарата. Для приготовления разведений можно использовать буферный раствор, например PBS, или, предпочтительно, среду MEM.

В обоих случаях используемый для разведения вируса раствор должен содержать 0,5% ЭТС и антибиотики.