Определение креатинина в крови на биохимическом анализаторе ROKI

2.2 Определение креатинина в крови на биохимическом анализаторе ROKI

Принцип метода: скорость образования окрашенного комплекса креатинина с пикриновой кислотой в щелочной среде пропорциональна концентрации креатинина в пробе.

Исследуемый материал: сыворотка или плазма крови. Гемолизированная сыворотка или плазма крови для анализа не пригодна.

Состав набора:

Реагент №1. Пикриновая кислота (100 мл).

Реагент №2. Натрий едкий (100мл).

Калибратор – раствор креатинина 17,7ммоль/л (2мл).

Подготовка реагентов к процедуре анализа и их стабильность:

Рабочий реагент: для исследования смешайте реагенты №1 и №2 в соотношении 1:1. нагрейте рабочий реагент до температуры 37⁰С.

Рабочий раствор калибратора: для исследования разведите калибратор в 100 раз дистиллированной водой. Полученная концентрация 177мкмоль/л. Процедура анализа:

Анализ проводится в термостатируемой (37⁰С) фотометрической кювете с длиной оптического пути 1см при 505нм против воздуха. В кювете смешайте рабочий реагент и исследуемый материал или калибратор в соотношении 5:1 (например, 1мл рабочего реагента и 0,2мл исследуемого материала). Через 1 минуту измерьте оптическую плотность (Е₁). Повторите измерение точно через 60сек (Е₂). Вычислите величину ΔЕ=Е₂ – Е₁.

Расчет концентрации креатинина (С):

В сыворотке (плазме)

;

ΔЕ_пробы – изменение оптической плотности исследуемой пробы,

ΔЕ_калибр – изменение оптической плотности калибровочной пробы,

177мкмоль/л – концентрация креатинина в разведенном калибраторе,

Если концентрация креатинина превышает 880мкмоль/л в сыворотке (плазме) разведите исследуемые образцы в 5 раз физиологическим раствором и повторите определение; результат умножьте на 5.

2.3 Определение мочевины в крови на

биохимическом анализаторе ROKI

Принцип метода: метод основан на оптическом тесте Варбурга с использованием сопряженных ферментативных реакций, приводящих к образованию в инкубационной среде НАД:

Мочевина + Н₂О← уреаза → 2NH₃ + CO₂;

NH₃ + α-кетоглутарат + НАДН₂ ← глутаматдегидрогеназа → L-глутамат + НАД + Н₂О.

Скорость окисления НАДН₂ в НАД пропорциональна концентрации мочевины в пробе.

Исследуемый материал: негемолизированная сыворотка или плазма крови.

Состав набора:

Реагент №1: 0,05М трис-буфер, рН 8,0 (60мл).

Реагент №2: Стабилизированный раствор фермента: уреаза – 8000Ед/л, глутаматдегидрогеназа – 700Ед/л (20мл).

Реагент №3: Стартовый реагент: НАДН₂ – 160мг/л (20мл).

Калибратор: Раствор мочевины – 13,3ммоль/л (800мг/л).

Процедура анализа:

I. Анализ с использованием исследуемого образца в качестве стартового реагента. Рабочий реагент: смешайте реагенты №1,2,3 в соотношении 3:1:1. В кювете фотометра с длиной оптического пути 1см смешайте рабочий реагент и исследуемый образец (или калибратор) в соотношении 100:1 и через 1мин измерьте величину экстинкции при 340нм против воды (Е₁). Точно через 60сек повторите измерение (Е₂). ΔЕ=Е₁ – Е₂.

II. Анализ с использованием НАДН₂ в качестве стартового реагента. Рабочий реагент: смешайте реагенты №1 и 2 в соотношении 3:1. В кювете фотометра (1см) смешайте рабочий реагент и исследуемый образец (или калибратор) в соотношении 80:1. Через 1мин добавьте реагент №3 в объеме, равном ¼ взятого объема рабочего реагента, перемешайте и через 1мин измерьте величину экстинкции при 340нм против воды (Е₁). Точно через 60сек повторите измерение (Е₂). ΔЕ=Е₁-Е₂.

Расчет концентрации (С) мочевины в исследуемом образце:

Сыворотка:

 или

.

2.4 Определение билирубина в крови на биохимическом анализаторе ROKI

Принцип метода: прямой (связанный, конъюгированный с глюкуроновой кислотой) билирубин непосредственно реагирует с диазотированной сульфаниловой кислотой, а общий билирубин – в присутствии кофеинового реагента с образованием окрашенного азосоединения. Интенсивность окраски реакционной среды пропорциональна концентрации билирубина и измеряется фотометрически при длине волны 535нм (500-560нм).

Исследуемый материал: сыворотка крови без следов гемолиза. Пробы стабильны 2 часа при комнатной температуре в защищенном от света месте.

Состав набора:

Реагент №1: Кофеиновый реагент (200мл).

Реагент №2: Сульфаниловая кислота (55мл).

Реагент №3: Натрия нитрит (2мл).

Реагент №4: Физиологический раствор (250мл).

Калибратор: 85,5мкмоль/л (в 2мл дистиллированной воды).

Подготовка реагентов к процедуре анализа и их стабильность:

Диазореактив: смешайте реактивы №2 и №3 в соотношении 100:2,5. Хранить в посуде из темного стекла при температуре 2-8⁰С.

Содержимое флакона с калибратором растворите в 2мл дистиллированной воды. После полного растворения концентрация билирубина равна 85,5мкмоль/л. Хранить в защищенном от света месте при температуре 2-8⁰С.

Процедура анализа:

	Опытная проба		Контрольная проба	Калибровочная проба
	Общий билирубин	Прямой билирубин
Сывортка, мл Реагент №1 Реагент №4 Калибратор Диазореагент	0,2 1,4 0,2 - 0,2	0,2 - 1,6 - 0,2	0,2 - 1,8 - -	- 1,4 0,2 0,2 0,2

Пробы тщательно перемешайте. Для определения прямого билирубина точно через 5 минут (при комнатной температуре) измерьте величину экстинкции опытной пробы против соответствующей контрольной пробы при 535нм (500-560нм). Для определения общего билирубина через 20 минут (при комнатной температуре) измерьте величину экстинкции опытной пробы против соответствующей контрольной пробы при 535нм (500-560нм). Экстинкцию калибратора измерьте против дистиллированной воды через 20 минут при 535нм.

Расчет концентрации билирубина в пробе (С):

, где

Е_пробы – экстинкция опытной пробы;

Е_калибр - экстинкция калибровочной пробы;

85,5 – концентрация билирубина в калибраторе.