Иммунологические методы с применением химических меток

3.7 Иммунологические методы с применением химических меток

Иммунологические реакции, такие, как иммунофлюоресценция, иммуноферментный анализ, радиоиммунологический анализ, иммунный блоттинг характеризуется применением различных способов детекции (обнаружения) комплекса антиген — антитело на основе химических или физических меток (флюоресцирующих веществ, ферментсубстратных взаимодействий, приводящих к окрашиванию реакционной смеси, радиоактивных изотопов), что имеет целью достижения большей чувствительности и специфичности анализа по сравнению с серологическими методами, основанными на естественных феноменах.

Ø Иммунофлюоресцентный метод. Иммуно-флюоресценция (ИФ) представляет собой люминесценцию биологического объекта в ультрафиолетовом спектре под микроскопом после его предварительной обработки специфическими антителами, меченными флюорохромом. ИФ была разработана Кунсом в 1942 г. и применяется как метод экспрессдиагностики инфекционных болезней. ИФ — универсальный иммунохимический метод, сочетающий достаточно точный морфологический анализ со специфичностью иммунологических методов.

Люминесцирующие сыворотки получают с помощью химической реакции между специфическими антителами иммунной сыворотки и флюоресцирующим красителем флюорохромом, в качестве которого чаще всего используют изотиоционат флюоресцеина. Такие меченые антитела называют конъюгатом. На практике используют флюорохромы, имеющую желто-зеленую, желтую и красную флюоресценцию.

Меченная флюорохромом сыворотка образует с антигеном комплекс антиген — антитело, который становится доступным наблюдению под микроскопом в ультрафиолетовых лучах, возбуждающих свечение флюорохрома. Метод ИФ применяют в различных модификациях, в частности используют прямой и непрямой варианты.

Метод прямой ИФ (синонимы: реакция иммунофлюоресценции — РИФ, метод флюоресцирующих антител — МФА) используют только для определения антигена: обнаружение бактерий и риккетсий в мазках, выявление вирусов в зараженных клетках, изучение клеточных антигенов.

Примером применения ИФ с целью выявления вирусных антигенов является диагностика бешенства у животных. Мазки-отпечатки мозга погибших животных обрабатывают люминесцирующей антирабической сывороткой. При положительном результате в цитоплазме нейроцитов наблюдают глыбки ярко-зеленого цвета (тельца Бабеша—Негри), представляющие собой скопление вирусных нуклеокапсидов. На обнаружении антигенов вирусов в мазках-отпечатках со слизистой оболочки основана экспресс-диагностика гриппа, парагриппа и аденовирусной инфекции.

Метод непрямой флюоресценции (реакция непрямой иммунофлюоресценции — РНИФ) обладает рядом преимуществ по сравнению с РИФ. Ее используют не только для определения антигенов, но и для титрования антител; реакция обладает большей чувствительностью, так как позволяет с помощью одной и той же антивидовой меченой сывороткой обнаружить различные бактериальные и вирусные антигены при применении в каждом случае на первом этапе постановки реакции немеченых специфических иммунных сывороток. Определение специфических антител РНИФ является основным методом диагностики геморрагической лихорадки с почечным синдромом, широко применяется для диагностики заболеваний, передающихся половым путем.

3.8 Иммуноферментный анализ (ИФА)

Иммуноферментный анализ (ИФА) проводят в два этапа: первый — взаимодействие антител с антигеном, второй — ферментативная индикация комплекса антиген — антитело за счет появления окрашивания реакционной смеси и регистрации окрашивания визуально либо спектрофотометрическим методом.

Существуют два варианта ИФА: твердофазный и жидко-фазный, различающиеся по способу разделения компонентов иммунохимической реакции. По сравнению с описанными ранее методами выявления антигенов и антител ИФА обладает существенными преимуществами:

—  высокой чувствительностью, позволяющей определять до 0,05 нг/мл вещества;

—  возможностью использования минимальных объемов исследуемого материала (1—2 мкл);

—  возможностью инструментального или визуального учета реакции;

—  экспрессностью и возможностью автоматизации всех этапов реакции.

ИФА в настоящее время широко используют в практике для диагностики многих инфекционных болезней бактериальной, грибковой этиологии, протозойных инфекций и гельминтозов, но особенно вирусных инфекций, в частности гепатитов А, В, С, D, Е, G, ВИЧ-инфекции, герпесвирусных, ротавирусных, аденовирусных, астровирусных, парвовирусных и других инфекций.

3.9 Иммунный блоттинг

Принцип метода иммунного блоттинга состоит в выявлении антител к отдельным антигенам возбудителя. С помощью этого метода определяют антитела к антигенам ВИЧ (гликопротеинам оболочки вируса, белкам сердцевины и ферментам вируса). Результаты иммунного блоттинга оценивают как положительные, сомнительные и отрицательные в зависимости от количественного и качественного набора выявленных антител.

Необходимо отметить, что иммунный блоттинг уступает по чувствительности ИФА, в некоторых случаях может регистрироваться отрицательный результат при наличии ВИЧ-инфекции у пациента. Однако возможность регистрации лож-ноположительных результатов в ИФА при ВИЧ-инфекции требует комплексного подхода в диагностике ВИЧ-инфекции с учетом, помимо результатов иммунологических реакций (ИФА, иммунный блоттинг), эпидемиологических и клинических данных.

3.10 Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

Метод ПЦР был разработан американским биохимиком Кэри Мюллисом в 1983 г. на основе применения открытой им термостабильной ДНК-полимеразы (Tag-полимеразы). Принцип метода состоит в увеличении в 10⁶—10⁸ раз числа копий специфического участка ДНК возбудителя, катализируемого in vitro ДНК-по-лимеразой в автоматическом режиме.

В искусственных условиях воспроизведение процесса репликации специфического для определенного вида или рода возбудителей участка генома возможно при условии знания его нуклеотидной последовательности. Применение методов детекции продуктов репликации таких участков (ампликонов) позволяет констатировать наличие возбудителя в исследуемой пробе.

Описанное выше комплементарное достраивание цепей начинается только в определенных стартовых блоках, представляющих собой короткие двунитевые участки. При присоединении таких блоков к специфическим участкам ДНК процесс синтеза новой цепи направляется только в выбранном участке, а не по всей длине цепи ДНК. Для создания стартовых блоков в заданных участках ДНК используют две олиго-нуклеотидные затравки, которые называют праймерами. Праймеры комплементарны последовательностям ДНК на левой и правой границах специфического фрагмента и ориентированы так, что достраивание новой цепи ДНК протекает только между ними.

К достоинствам метода ПЦР следует отнести:

—  высокую чувствительность, позволяющую определять 10—1000 клеток в пробе;

—  высокую специфичность, поскольку в исследуемом материале выявляется уникальный для данного возбудителя фрагмент ДНК;

—  универсальность процедуры обнаружения различных возбудителей из одной биопробы;

— высокую скорость анализа (4—4,5 ч);

— возможность диагностики не только острых, но и латентных инфекций.

ПЦР эффективна для диагностики труднокультивируемых, некультивируемых и персистирующих форм микроорганизмов. Ее использование целесообразно для выявления возбудителей с высокой антигенной изменчивостью и внутриклеточных паразитов.

Применение ПЦР эффективно для диагностики широкого спектра бактериальных и вирусных инфекций.

В последнее время достаточно успешно реализуются количественные методы ПЦР-анализа, позволяющие определить концентрацию возбудителя в материале (микробную или вирусную нагрузку), например оценить репликативную активность вируса гепатита В, Си ВИЧ.

Однако следует иметь в виду, что метод ПЦР имеет и свои ограничения, в частности, для диагностики инфекций, вызванных условно-патогенной аутофлорой.

3.11 Гибридизация нуклеиновых кислот

Гибридизация нуклеиновых кислот, как и ПЦР, позволяет идентифицировать возбудителя в пробе без предварительного выделения. Для проведения анализа синтезируют одноцепочечный ДНК- или РНК-зонд, комплементарный специфическим нуклеотидным последовательностям возбудителя. Зонд метят радионуклидом, ферментом или другой легко распознаваемой меткой. Исследуемый материал подвергают обработке с целью лизиса микроорганизмов, находящихся в биопробе, выделения и денатурации ДНК. Далее проводят инкубацию зонда с исследуемым образцом и измерение количества меченой ДНК, вступившей в гибридизацию с ДНК, находящейся в исследуемой пробе. Реакция может происходить как на твердофазных сорбентах, так и в растворе, однако обязательным условием является отмывка несвязавшихся количеств меченого зонда. Чувствительность метода гибридизации нуклеиновых кислот уступает таковой ПЦР и составляет 10³ микробных клеток в пробе.

4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

После получения результатов обследования и с учетом эпидемиологических данных устанавливают заключительный диагноз. В диагнозе указывают нозологическую форму, шифр по МКБ-10, метод подтверждения диагноза, тяжесть и особенности течения болезни, период болезни, наличие осложнений и сопутствующих заболеваний, например: «Брюшной тиф (гемокультура), тяжелое течение болезни, период разгара; осложнение — кишечное кровотечение; сопутствующее заболевание — сахарный диабет». Максимально точно сформулированный и подробный диагноз определяет терапевтическую тактику.

В ряде случаев, когда клинических данных недостаточно, а лабораторные исследования не позволяют установить этиологию болезни, допускается постановка синдромного диагноза (например, пищевая токсикоинфекция, острое респираторное заболевание, ОРВИ).

диагностика метод инфекция заболевание

5. ИСПОЛЬЗОВАНАЯ ЛИТЕРАТУРА

1. Ющук, Венгеров, Инфекционные болезни,- М 2003г.

2. Лекционные материалы

3. http://www.epidemiolog.ru/

4. Терапия, руководство для врачей, под редакцией акад. Чучалина,1997г.