Навигация
Застосування флуориметрії
49569
знаков
4
таблицы
8
изображений
1.2 Застосування флуориметрії
Ідентифікація. Спектри флуоресценції специфічні для визначених речовин. Тому флуоресценція може бути застосована для їх ідентифікації[5].
Кількісний аналіз. При кількісних визначеннях інтенсивність флуоресценції розчину випробуваного зразка порівнюють з інтенсивністю флуоресценції розчину стандартного зразка флуоресціюючого речовини відомої концентрації, яка вимірюється в ідентичних умовах на одному і тому ж приладі[5].
Методика. Розчиняють випробуваний зразок в розчиннику або в суміші розчинників, зазначених у нормативній документації. Переносять розчин в кювету або пробірку флуориметра і опромінюють збудливим світлом при довжині хвилі, зазначеної в нормативної документації. Вимірюють інтенсивність світла, що випускається під кутом 90о до збудливій світла після проходження через світлофільтр або монохроматор, що пропускає переважно випускається діапазон довжин хвиль[5].
Послідовність виконання аналізу. Спочатку в прилад поміщають розчинник або суміш розчинників, використовуваних для розчинення речовини, і встановлюють пристрій, що реєструє на нульове значення. Потім вводять розчин стандартного зразка і встановлюють чутливість приладу таким чином, щоб відгук показань був не менше 50. Якщо для регулювання чутливості потрібна зміна ширини щілини, повинні бути повторені обнулення приладу на розчинник і вимірює інтенсивність флуоресценції стандартного зразка. Після цього вводять розчини досліджуваних зразків невідомої концентрації і реєструють показання приладу. У разі лінійної залежності інтенсивності світла, що випускається від концентрації речовини розраховують останню в випробуваному розчині (C) за формулою[5]:
, (1.2)
де C0 - концентрація речовини в стандартному розчині;
I - інтенсивність світла, що випускається випробуваним розчином;
I0 - інтенсивність світла, що випускається стандартним розчином[5].
Якщо інтенсивність флуоресценції не пряма пропорційна концентрації розчину, вимір може бути зроблено з використанням калібрувальної кривої.
У деяких випадках вимір флуоресценції випробуваного зразка може бути виконано щодо незалежного стандарту (наприклад, флуоресцентного скла або розчину іншого флуоресцентного речовини). В якості стандартів можуть бути використані: розчин відомої концентрації хініну в 0,05 М розчині сірчаної кислоти або розчин флуоресцеїну в 0,1 М розчині натрію гідроксиду. У таких випадках концентрацію випробуваного зразка слід визначати з використанням попередньо отриманої в тих же умовах калібрувальної кривої[5].
2 АНАЛІЗ ТЕХНІЧНОЇ СКЛАДОВОЇ
Для проведення флуориметричного аналізу використовують прилади двох типів: фільтраційний флуориметр і Спектрофлуориметр. Фільтраційний флуориметр складається з джерела випромінювання, первинного фільтра довжин хвиль, камери для зразка, вторинного фільтра довжин хвиль і системи детектування флуоресценції. Як правило, детектор поміщений під кутом 90о до збудливого світлового потоку. Геометрія прямого кута передбачає детектування тільки виробленого флуоресцентного сигналу. Однак детектор все-таки отримує частину збудливого випромінювання в результаті розсіювання властивостей самого розчину, а також через присутність в розчині твердих частинок. Для усунення цього залишкового розсіювання використовуються спектральні фільтри. Первинний фільтр відбирає короткохвильове випромінювання, здатне до порушення випробовуваних зразків, вторинний фільтр пропускає флуоресценцію в довгохвильовій області, але блокує розсіяне збудження[5].
Детектори флуориметрії перетворять оптичний сигнал в електричний за допомогою фотопомножувачів різних типів. Кожен тип детектора має специфічні властивості: спектральна область максимальної чутливості, ступінь посилення, співвідношення сигнал / шум[5].
Спектрофлуориметри відрізняються від фільтраційних флуориметрів тим, що замість спектральних фільтрів в них використовуються монохроматори типу призми або решітки. Ці прилади є кращими для аналітичних цілей. У спектрофлуориметрів монохроматори забезпечені щілинами. Чим вже щілину, тим вище дозвіл і спектральна чистота, але менше чутливість. Вибір розміру щілини визначається поділом між довжинами хвиль збудливого і випускається випромінювання і необхідним рівнем чутливості[5].
Як джерела збудливого випромінювання в флуориметр використовують[5]:
- Ртутні лампи низького тиску, що надають велику кількість довжин хвиль збудження, але не є джерелом випромінювання рівномірного спектра;
- Ксенонові газорозрядні лампи, що забезпечують високоінтенсивне майже рівномірне випромінювання в широкому діапазоні спектра (300 - 800 нм) і досить інтенсивне в короткохвильовій області аж до 200 нм;
- Лазери, що випромінюють світло високої інтенсивності в дуже вузькому інтервалі довжин хвиль (не більше 0,01 нм) і дозволяють завдяки цьому не використовувати монохроматори або первинні світлофільтри;
- Світлодіоди і світлодіодні матриці, що випромінюють світло в певних діапазонах довжин хвиль[5].
Для розміщення аналізованих проб в флуориметр використовують, як правило, прямокутні кварцові кювети, відполіровані з усіх 4 вертикальних сторін, іноді - циліндричні кювети або пробірки. Зазвичай обсяг випробовуваних зразків становить 2 - 3 мл, але до деяких приладів додаються кювети місткістю від 100 до 300 мкл або капілярні тримачі для ще меншого обсягу[5].
Вимірювання флуоресценції. Флуоресценцію визначають в розчинах з концентрацією від 10-5 М і менш, в діапазоні, для якого спостерігається пряма залежність інтенсивності флуоресценції від концентрації. При більш високих концентраціях все більш значна частина надходить світла абсорбується зразком поблизу поверхні кювети, і лінійна залежність величини сигналу від концентрації речовини порушується[5].
Всі виміри інтенсивності флуоресценції повинні бути скоректовані з розчинником.
Інтенсивність флуоресценції залежить від:
- Температури,
- Розчинника,
- Величини рН випробуваного розчину,
- Присутності в розчині сторонніх часток,
- Концентрації кисню в випробуваному розчині,
- Стороннього освітлення.
Ефективність флуоресценції обернено пропорційна температурі. Для деяких речовин ефективність флуоресценції може знижуватися на 1 - 2% при підвищенні температури на 1 ° С. У таких випадках потрібно термостатировання зразків.
Інтенсивність і спектральний розподіл флуоресценції залежить від розчинника. Багато з'єднання, флуоресціюючі в органічних розчинниках, практично не флуоресціюють в воді[5].
Перед вимірюванням флуоресценції з випробуваного розчину фільтруванням або центрифугуванням повинні бути видалені тверді частинки, так як вони можуть поглинати деяку частку збудливою енергії, дезактивувати порушені молекули або завищувати вимірювану величину через багаторазових відображень в кюветі з зразком[5].
Інтенсивність флуоресценції обернено пропорційна концентрації кисню, що є сильнодіючим гасителем флуоресценції. За ступенем гасіння флуоресценції можна визначати концентрацію кисню в навколишньому середовищі. Для видалення кисню через випробуваний зразок пропускають азот або гелій.
Більшість флуоресціюючих речовин чутливо до світла. Під час опромінювання під флуориметрі вони можуть піддаватися фоторозкладання з утворенням інших флуоресціюючих продуктів. Такі ефекти виявляються при спостереженні за відгуком детектора в часі і можуть бути знижені шляхом приглушення світла за допомогою світлофільтрів або екранів[5].
Похожие работы
... і. Початок розвитку цього методу відноситься до глибокої старовини. Віками люди спостерігали за світінням у темряві гнилого дерева, комах, однак природа цього явища тривалий час залишалася нерозкритої. Рукописні зведення про люмінесценцію починаються з Каскаріоло, що у 1604 р. синтезував першу штучну речовину здатну до люмінесценції (болонский фосфор). Пізніше алхіміки відкрили цілий ряд мінерал ...
0 комментариев