1.3.2. Морфологические и биохимические проявления апоптоза
Прежде всего это морфологические признаки апоптоза, состоящие в уменьшении размеров, сморщивании клетки, уплотнении и фрагментации хроматина. В ядре формируются осмиофильные скопления хроматина, обычно прилежащие к ядерной оболочке. Эти изменения служат самым ранним проявлением апоптоза, предшествующим процессам деградации [Демин А.А. и соавт.,1983]. На этой стадии прогрессирования апоптоза может быть приостановлено действие ингибиторов, всвязи с чем данная стадия развития клеточной гибели обозначается как преапоптоз. Затем в ядерной мембране образуются инвагинации, и хроматиновые фрагменты отшнуровываются от ядра. Такие фрагменты, окруженные мембраной, называют апоптотическими тельцами. В цитоплазме происходит конденсация и сморщивание гранул без их разрушения, расширение эндоплазматического ретикулума. Для апоптоза характерна потеря клеточной мембраной микроворсинок и нормальной складчатости, отделение клетки от субстрата, формирование на ее поверхности пузырей [Барышников А.Ю. и соавт.,1994].
В отличие от некроза, когда одновременно гибнут массы соседствующих клеток, апоптоз развивается изолированно в единичных клетках. Если в случае некроза из клеток в среду поступает внутриклеточное содержимое, в частности лизосомы, что нередко приводит к развитию или прогрессированию воспаления, то при апоптозе подобные проявления отсутствуют [Мушецяну К и соавт.,1965]. Клетки, подвергшиеся апоптозу (а иногда и находящиеся в процессе апоптоза), и апоптотические тельца быстро фагоцитируются, причем не только макрофагами, но и “непрофессиональными” фагоцитами (например, мезангиальными клетками почек) [Bnuin de P.S. e.a.,1995; Garrido F. e.a.,1995].
Одно из основных проявлений апоптоза на биохимическом уровне реализуется в ядре клетки и состоит в фрагментации ДНК. Сначала происходит образование крупных фрагментов ДНК, содержащих 700, 200-250, 50-70 тысяч пар оснований (т.п.о.), позже 30-50 т.п.о. Уже на этой стадии регистрируется конденсация хроматина и выпячивание ядерной мембраны, характерные для апоптоза. Полагают, что именно эти начальный этап фрагментации хроматина является ключевым событием апоптоза, после осуществления которого процесс становится необратимым [Погорелов В.М., Козинец Г.И.,1995].
Следующий этап фрагментации ДНК - ее межнуклеосомная деградация, т.е. расщепление в результате формирования разрывов (в основном двунитевых) между нуклеосомами с формированием фрагментов, содержащих 180-190 п.о. Именно эти фрагменты выявляются в виде “лесенки” при электрофорезе ДНК апоптотических клеток, который широко используется для идентификации апоптоза [Казанова Л.И.,1979; Marmur J.,1961].
Деградация хроматина при апоптозе является активным процессом, она зависит от температуры, требует синтеза РНК и белка de novo. Осуществление различных этапов деградации ДНК связывают с проявлением активности разных ферментов. Считают, что межнуклеосомная деградация при апоптозе обусловлена активацией резидентной ядерной Са2Мg2зависимой эндонуклеазы [Исаева М.П. и соавт.,1998]. Выделена эндонуклеаза с молекулярной массой 18 кД. Мало сведений о ферментах, обеспечивающих появление крупных разрывов ДНК. По одним сведениям, они не зависят от Са2+ (хотя и зависят от Мg2+), по другим данным, формирование крупных фрагментов ДНК так же зависит от Са2+. Феномен апоптоза неоднороден и при действии различных его индукторов, события, по крайней мере до определенного этапа, могут развиваться по разнообразным сценариям, и лишь достигнув определенной точки конвергенции, различные пути сходятся, а механизмы реализации гибели оказываются идентичными. К ключевым дистальным механизмам реализации апоптоза относят активацию цистеиновых и сериновых протеиназ. Ингибиторы сериновых протеиназ подавляют апоптоз, индуцированный глюкокортикоидами [Bnuin de P.S. e.a.,1995; Garrido F. e.a.,1995].
Наблюдаемые при апоптозе уплотнение и деформация наружной и внутриклеточной мембран, формирование устойчивого к действию детергенов покрова, сморщивание цитоплазматических гранул связывают с перекрестным сшиванием белков, обусловленным активацией Са2-зависимой трансглутаминазы типа II, что служит обязательным и характерным биохимическим признаком апоптоза. Непосредственной причиной гибели клеток при апоптозе, вероятно, служит истощение пула АТФ, являющееся следствием активации поли (ADP- рибоза)полимеразы в ответ на повреждение ДНК [Барышников А.Ю., Шишкин Ю.В.,1996; Marmur J.,1961].
1.3.3. Распознавание апоптотирующей клетки макрофагами
К настоящему времени расшифровано три механизма, с помощью которых макрофаги распознают клетки, подвергающиеся апоптозу, и удаляют их.
Распознавание, а следовательно и адгезия макрофагов к клеткам, вступившим на путь апоптоза, почти полностью блокируется при добавлении в среду N-ацетилгалактозамина и галактозы. Из этого следует, что ранним мембранным проявлением апоптоза является специфическая перестройка углеводных компонентов мембраны с потерей сиаловых кислот, наружной экспрессией сахаров и снижением общего отрицательного потенциала наружной поверхности мембраны. Потеря терминальных сиаловых кислот с боковых цепей мембранных гликопротеидов влечет за собой то, что экранированные в обычных условиях ацетилглюкозамин, N-ацетилгалактозамин и галактоза приобретают возможность взаимодействовать с лектинами макрофагов [Taga H. e. a. , 1994]
Другой тип распознавания апоптотирующих клеток осуществляется с помощью макрофагального 43 интегринового рецептора. Тромбоспондин, синтезируемый и выбрасываемый в микроокружение макрофагами, выполняет роль молекулярной скрепки между апоптотирующей клеткой и макрофагом. Существенную роль в этом процессе играет мембранный мономер 88кД, больше известный как CD36. Третий механизм распознавания клеток, вступивших на путь апоптоза, состоит в том, что на самых ранних этапах программированной гибели клеток, еще до формирования апоптотических телец, происходит инверсия мембранных фосфолипидов. В обычных условиях наружный лепесток мембранного бислоя содержит, в основном, нейтральные фосфолипиды, сфингомиелин и фосфатидилхолин, в то время как отрицательно заряженные фосфолипиды структурированы на внутреннем лепестке мембранного бислоя. У апоптотирующих клеток эта мембранная асимметрия нарушается, и они экспрессируют наружу фосфатидсерин, который распознается специфическим макрофагальным рецептором [Taga H. e. a., 1994; T. Uehara e. a., 1992].
Следует отметить, что тип распознавания апоптотирующих клеток макрофагами может сильно зависеть от типа клеток и от стадии процесса программированной гибели [Исаева М.П. и соавт.,1998].
0 комментариев