Выделение ДНК лимфоцитов

2.2.2. Выделение ДНК лимфоцитов

В чистые полипропиленовые пробирки типа “Eppendorf” объемом 1,5 мл вносили 3 мкл носителя и 450 мкл денатурирующего раствора. Добавляли 450 мкл исследуемой сыворотки или плазмы крови, используя наконечники с фильтрами. Тщательно перемешивали на вортексе в течение 10 секунд. Затем инкубировали при комнатной температуре 10 минут. После этого центрифугировали 15 секунд при 12 тыс. об/мин, добавляли 100 мкл хлороформа и перемешивали на вортексе 5 секунд. Далее вновь центрифугировали при 12 тыс. об/мин 10 минут. Переносили до 300 мкл верхней фазы в чистую полипропиленовую пробирку, содержащую 300 мкл изопропилового спирта, перемешивали на вортексе 5 секунд. Чтобы избежать контаминации, данную процедуру проводили используя наконечники с фильтрами. После этого центрифугировали при 12 тыс. об/мин 15 минут. Удаляли супернатант, используя водоструйный насос, в колбу-ловушку. К осадку добавляли 1 мл промывочного раствора, перемешивали и вновь центрифугировали при 12 тыс. об/мин 5 минут. Далее как можно тщательнее удаляли супернатант, осадок подсушивали 10-20 минут, добавляя 30 мкл деионизированной воды, закрывали пробирки, инкубировали 10 минут при комнатной температуре, перемешивали встряхиванием.

2.2.3. Исследование фрагментации ДНК лимфоцитов

15 мкл суспензии ДНК каждой пробы использовали для электрофоретической идентификации апоптоза клеток, 35 мкл для оценки содержания фрагментированной ДНК в лимфоцитах.

2.2.4. Электрофорез ДНК лимфоцитов

Электрофорез проводили в 1,5 % агарозном геле с добавлением 1 мкг/мл бромистого этидия при напряжении 20 В/см в течение 30 минут. Полученные гели просматривали и фотографировали в УФ-свете.

На электрофореграммах апоптотическая фрагментация ДНК выявлялась в виде “лесенки” из фрагментов ДНК различной длины. Некроз клеток обуславливал “размазанный” характер зоны миграции ДНК. Полоса свечения интактной ДНК находилась в районе старта.

2.2.5. Определение содержания фрагментированной ДНК в лимфоцитах

Содержание ДНК в пробах определяли дифениламиновым методом [Шаткин А., 1972]. К 1 мл гидролизованной ДНК добавляли 2 мл реактива Дише (1 г дифениламина, 100 ледяной уксусной кислоты, 2,75 мл концентрированной серной кислоты) и инкубировали в течение 16-20 часов при 30С. После инкубировали в кипящей водяной бане 10 минут для развития окраски. После этого пробы охлаждали и исследовали с помощью спектрофотометра СЭФ-46 при длине волны 600 нм. В качестве раствора сравнения использовали аналогичный раствор без ДНК.

Содержание ДНК (мкг) в лимфоцитах рассчитывали по калибровочной кривой с использованием стандартного раствора ДНК клеток тимуса теленка (1 мг/мл), 0,5 мл которого предварительно смешивали с равным объемом 0,1 Н раствора игидролизовали в течение 10 минут вкипящей водяной бане и разбавляли 0,5 Н раствором HCIO₄ до необходимой концентрации.

2.3. Исследование морфологии апоптоза лимфоцитов

После инкубации пробы центрифугировали 10 минут при 1000 об/мин, надосадочную жидкость удаляли, а из осадка готовили мазки, которые окрашивали азур-эозином в течение 40-50 минут. Для оценки морфологии апоптотических изменений лимфоцитов использовали цитопатологические критерии, предложенные S. G. Martin e.a. [Маянский А. Н., 1997]

2.4. Статистическая обработка результатов

Полученные данные обрабатывали на Statistica for Windows (версия 6.0) и пакета программ Microsoft Excel (1997). Для всех имеющихся выборок данных проверена гипотеза нормальности распределения (по критерию Колмогорова-Смирнова). Для каждой выборки вычисляли средневыборочные характеристики.

Х - среднее арифметическое;

- среднее квадратичное отклонение;

m – ошибка среднего;

по формуле:

Х = а / n (1);

 = (2);

m =  (3);

где а – величины, полученные при исследовании;

n – число исследований.

При соответствии нормальному закону распределения признака в исследуемых выборках, проверка гипотезы о равенстве средних выборочных величин производилась с использованием t-критерия Стьюдента. Для оценки достоверности различий выборок, не подчиняющихся критерию нормального распределения, использовали непараметрический критерий Манна-Уитни. Различия считали достоверными, при уровне значимости p