ММ трис-HCl, рН 8,0

50 мМ трис-HCl, рН 8,0,

10 мМ Na₂ЭДТА,

10 мМ NaCl.

Затем обрабатывали пробу РНКазой, свободной от ДНКазы,при 37^оС в течение 1 часа в концентрации 100 мкг/мл. После этого экстрагировали ДНК равным объемом смеси фенол-хлороформ (1:1) два раза и проводили диализ при 10^оС в течение 36 часов против 10 л буфера TE (10 мМ трис-HCl, 1 мМ Na₂ЭДТА, рН 7,5), меняя буфер через каждые 12 часов (Маниатис и др., 1984).

КОНСТРУИРОВАНИЕ БИБЛИОТЕКИ кДНК

Выделение поли(A)⁺РНК.

Для ингибирования РНКазы все растворы, не содержащие трис, обрабатывали 0,1% диэтилпирокарбонатом 12 часов при 37^оС и автоклавировали. Посуду прокаливали при 250^оС в течение 4 часов. Поли(A)⁺РНК выделяли из суммарной РНК лейкоцитов стерляди методом хроматографии на олиго(dT)-целлюлозе. Для этого РНК растворяли в воде, прогревали при 65^оС в течение 5 мин, добавляли равный объем 2-кратного буфера для нанесения РНК (40 мМ трис-HCl, рН 7,6, 1 М NaCl, 2 мМ Na₂ЭДТА, 0,2% SDS) и трижды пропускали через колонку с олиго(dT)-целлюлозой. Затем промывали колонку 5-10 объемами буфера для нанесения и 4 объемами этого же буфера, содержащего 0,1 М NaCl. После этого элюировали поли(A)⁺РНК в 2-3 объемах воды, обработанной диэтилпирокарбонатом, добавляли 2,2 объема этанола и осаждали центрифугированием в течение 10 мин при 12000 g при 4^оС (Маниатис и др., 1984).

Синтез кДНК.

Синтез кДНК проводили в соответствии с протоколом фирмы Stratagene. По матрице поли(A)⁺РНК синтезировали первую цепь кДНК (рис. 9).

Реакционная имела состав:

5 мкл 10-кратного буфера для синтеза первой цепи,

3 мкл смеси метил-dНTФ,

2 мкл раствора праймер-линкера (1.4 мкг/мкл),

1 мкл ингибитора РНКазной активности,

1.5 мкл фермента обратная транскриптаза (50 е.а./мкл),

вода до суммарного объема 50 мкл.

Смесь инкубировали при 37^оС в течение 1 часа. Затем охлаждали до 0^оС и добляли компоненты для синтеза второй цепи кДНК:

20 мкл буфера для синтеза второй цепи,

6 мкл смеси dНTФ,

88,9 мкл стерильной воды,

2 мкл ³²Р-dНTФ (800 Ки/мМ),

2 мкл раствора РНКазыH (1.5 е.а./мкл),

11.1 мкл ДНК полимеразы I.

Смесь инкубировали при 16^оС в течение 2,5 часов, затем охлаждали до 0^оС и добавляли компоненты для застройки “липких” концов:

23 мкл смеси дНTФ,

2 мкл Pfu ДНК полимеразы (2,5 е.а./мкл).

Смесь инкубировали при 72^оС в течение 30 мин.

Затем проводили экстракцию равным объемом смеси фенол-хлороформ (1:1) и равным объемом хлороформа, после чего отбирали водную фазу, добавляли 20 мкл 3М NaAc и 400 мкл 96% этанола и осаждали кДНК центрифугированием при 12000 g в течение 12 мин.

Сшивка молекул кДНК с вектором.

кДНК растворяли с EcoR I адапторами (рис. 9) и инкубировали при 4^оС в течение 30 мин. Затем добавляли компоненты для сшивки молекул адапторов и молеул кДНК:

праймер-линкер

5' CTCGAGTTTTTTTTTTTT 3'

3' AAAAAAAAAAAA 5'

поли(A)⁺РНК

Xho I сайт 1-я цепь EcoR I адаптор

5' р-TCGAGTTTTTTTTTTTT,,,,,,,,CTCGTGCCG-р 3'

3' р-CAAAAAAAAAAAA GAGCACGGCTTAA-р 5'

2-я цепь

Xho I сайт кДНК EcoR I сайт

5' CTCGAGTTTTTTT,,,,,,,,,CTCGTGCCGAATTC 3’

3' GAGCTCAAAAAAA GAGCACGGCTTAAG 5’

ДНК вектора ДНК вектора

Рис. 9. Схема синтеза кДНК по матрице поли(A)⁺РНК и сшивки с плазмидным вектором

pBluescript KS(+) по сайтам EcoR I и Xho I.

Обозначения:,,,,, - метилированная цепь кДНК, -неметилированная цепь кДНК.

1 мкл 10-кратного буфера лигирования,

1 мкл 10 мМ рATФ,

1 мкл фермента ДНК лигазы фага Т4 (4 е.а./мкл).

Смесь инкубировали при 4^оС в течение 2-х суток, после чего инактивировали лигазу прогреванием при 70^оС в течение 30 мин, охлаждали до комнатной температуры и добавляли компоненты для фосфорилирования концевых нуклеотидов:

1 мкл 10-кратного буфера лигирования,

2 мкл 10 мМ рATФ,

6 мкл стерильной воды,

1 мкл фермента полинуклеотидной киназы фага Т4 (10 е.а./мкл).

Реакционную смесь инкубировали при 37^оС в течение 30 мин. Затем охлаждали до комнатной температуры и добавляли компоненты для образования липких концов по сайту рестрикции эндонуклеазы Xho I:

28 мкл буфера 4,

3 мкл Xho I (40 е.а./мкл).

Смесь инкубировали при 37^оС в течение 1,5 часа. Затем добавляли 5 мкл 10-кратного буфера STE (1 М NaCl, 200 мМ трис-HCl, рН 7,5, 100 мМ Na₂ЭДТА) и пропускали через колонку с гелем сефакрил С-500. Фракции, содержащие молекулы с размером более 500 пн объединяли и экстрагировали ДНК равным объемом смеси фенол-хлороформ (1:1) и равным объемом хлороформа. Затем добавляли двойной объем этанола, осаждали кДНК центрифугированием, промывали 80% этанолом и растворяли в 10 мкл воды. Для лигирования брали 5 мкл раствора кДНК (600 нг) и 2 мкл раствора вектора pBluescript KS(+) (1 мкг), имеющего "липкие" дефосфорилированные концы по сайтам рестрикции эндонуклеазами EcoR I и Xho I (рис. 9).

Затем добавляли 1 мкл 10-кратного буфера 3, 1 мкл 10 мМ раствора рATФ и 1 мкл фермента лигазы фага Т4 (4 е.а./мкл). Смесь инкубировали при 4^оС в течение 2-х суток, после чего экстрагировали равными обьемами фенол-хлороформа и хлороформа.

Амплификация библиотеки.

Электротрансформацию проводили как описано в п. Трансформация прокариотических клеток, после чего высевали 1/1000 объема (2,5 мкл) среды SOC на селективную среду с ампициллином (50 мкг/мл) для определения количества трансформированных клеток. Остальную часть помещали в 100 мл среды LB с ампициллином (50 мкг/мл) и инкубировали при 37^оС при перемешивании до тех пор, пока оптическая плотность не достигнет величины D₅₅₀=2-2,5. Затем отбирали 1,6х10¹¹ клеток, осаждали их центрифугированием, суспендировали в 4 мл среды LB и перемешивали с 4 мл глицерина. Полученную библиотеку хранили при -70^оС.

ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ

Реакционная смесь полимеразной цепной реакции (ПЦР) содержала следующие компоненты:

100 нг ДНК матрицы,

100 нг невырожденного праймера,

500 нг вырожденного праймера,

5 мкл 2 мМ раствора дНTФ,

5 мкл 1-кратного буфера (10 мМ трис-HCl, рН 8,8, 50 мМ KCl, 1,5 мМ MgCl₂, 0,001% желатин),

1 мкл Taq полимеразы,

вода до конечного объема 50 мкл (Dieffenbach and Dveksler, 1995).

Температурный режим ПЦР.

Реакционную смесь инкубировали при 95^оС в течение 5 мин, после чего добавляли Taq полимеразу и использовали температурный режим, при котором в течение первых 18 циклов температуру отжига праймеров понижали на 3^оС черех каждые три цикла:

1^й-18^й циклы 95^оС - 1 мин (денатурация ДНК),

50-35^оС - 1 мин (отжиг праймеров),

72^оС - 2 мин (полимеризация).

19^-й-30^-й циклы: 95^оС - 1 мин,

50^оС - 1 мин,

72^оС - 2 мин.

31^-й цикл: 95^оС - 1 мин,

50^оС - 1 мин,

72^оС - 10 мин.

СУБКЛОНИРОВАНИЕ ДНК

Фрагменты ДНК, полученные в результате ПЦР, разделяли в 1% агарозном геле и выделяли как описано в п. Выделение ДНК из геля. Затем осаждали ДНК этанолом, растворяли в 5-10 мкл воды и добавляли компоненты для удаления выступающих нуклеотидов с 3' конца ДНК:

1 мкл 10-кратного буфера (200 мМ трис-HCl, рН 8,2, 100 мМ KСl, 60 мМ (NH₄)₂SO₄, 20 мМ MgCl₂, 1% тритон Х-100 и 100 мкг/мл бычий сывороточный альбумин),

1 мкл 10 мМ dНTФ,

1 мкл Pfu ДНК полимеразы (2,5 е.а./мкл),

воду до конечного объема 10 мкл.

Смесь инкубировали 30 мин при 72^оС после чего охлаждали до 0^оС и добавляли компоненты для сшивки с вектором pBluescript KS(+) по сайту рестрикции Sma I:

1 мкл расщепленного вектора (0,5 мкг),

1 мкл 10-кратного буфера (50 мМ трис-HCl, рН 7,5, 7 мМ MgCl₂, 1 мМ ДТТ),

1 мкл 10 мМ дATФ,

1 мкл ДНК лигазы фага Т4 и воду до конечного объема 10 мкл.

Смесь инкубировали одни сутки при комнатной температуре и затем использовали для химической трансформации клеток E.coli. Трансформированные клетки высевали на селективную среду: 1,5% LB-агар с ампициллином (50 мкг/мл), тетрациклином (15 мкг/мл), ИПТГ (2 мМ), X-Gal (500 мкг/мл) и инкубировали 14 часов при 37^оС. После этого отбирали колонии белого цвета (Маниатис и др., 1984; Dieffenbach and Dveksler, 1995).

СКРИНИНГ БИБЛИОТЕКИ кДНК

Библиотеку кДНК высевали на чашки Петри с 1,5% LB-агаром с ампициллином (50 мкг/мл) из расчета 4000 колоний на чашку и инкубировали при 37^оС до тех пор пока колонии не достигнут 0,5-1 мм в диаметре. Колонии переносили на нейлоновую мембрану и инкубировали при комнатной температуре в денатурирующем растворе (0,5 М NaOH, 1,5 М NaCl) в течение 7 мин и два раза по 2 мин в нейтрализующем растворе (1,5 М NaCl, 0,5 М трис-HCl, рН 7,5). Затем споласкивали мембрану в 2-кратном буфере SSC (0,3 М NaCl, 0,03 М цитрат натрия), высушивали и фиксировали ДНК в течение 10 мин ультрафиолетовым излучением с длиной волны 310 нм. После этого мембрану помещали в 50 мл предгибридизационного раствора (раствор 1), содержащего:

6-кратный SSC (0.9 М NaCl, 0,09 М цитрат натрия),

5-кратный раствор Денхардта (0,1% бычий сывороточный альбумин, 0,1% фикол, 0,1% поливинилпиролидон),

0,5% SDS,

10% декстран сульфат,