Мкг денатурирированной ДНК цыпленка

500 мкг денатурирированной ДНК цыпленка,

и инкубировали 1 час при 55^оС. После этого добавляли меченую ³²P-дATФ ДНК зонда и инкубировали 12-18 часов при 55^оС при постоянном покачивании.

После гибридизации проводили промывание мембраны два раза по 10 мин в 200 мл 2-кратного SSC + 0,1% SDS при комнатной температуре, 15 мин в 1-кратном SSC + 0,1% SDS% при 55^оС и два раза по 10 мин в 0,1-кратном SSC + 0,1% SDS при 55^оС. Экспонирование проводилось в течение 12 часов при -70^оС с рентгеновской пленкой (Маниатис и др., 1984).

ОПРЕДЕЛЕНИЕ НУКЛЕОТИДНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ДНК

Нуклеотидную последовательность ДНК определяли по методу Сэнгера (Sanger et al., 1977). 5 мкг плазмидной ДНК, очищеной гель-фильтрацией на колонке с биогелем П-10, денатурировали в 50 мкл 0.2 М NaOH при 37^оС в течение 30 мин, затем добавляли 5 мкл 3 М NaAc, рН 5,1, двойной объем этанола и инкубировали 30 мин при температуре -70^оС. После этого осаждали ДНК центрифугированием при 12000 g в течение 12 мин и промывали осадок 100 мкл 80% этанола. Осадок ДНК высушивали при комнатной температуре и растворяли в 7,5 мкл воды, добавляли 2 мкл 5-кратного буфера (200 мМ трис-HCl, рН 7,5, 100 мМ MgCl₂, 250 мМ NaCl), 0,5 мкл праймера (50 нг) и инкубировали 30 мин при 37^оС. После этого пробирку помещали в лед и добавляли 1 мкл 0,1 М ДТТ, 2 мкл 1,5 мкМ дНTФ без дATФ, 0,5 мкл раствора ³⁵S-дATФ и 2 мкл ДНК полимеразы фага Т7 (2,5 е.а./мкл). Затем инкубировали 3 мин при 20^оС и сразу отбирали по 3,5 мкл в четыре пробирки, каждая из которых содержала по 2,5 мкл 80 мкМ смеси четырех дНTФ, 50 мМ NaCl и 8 мкМ одного из ддНTФ. Инкубировали 5 мин при 37^оС и добавляли по 4 мкл стоп-раствора (95% формамид, 20 мМ Na₂ЭДТА, 0,05% бромфеноловый синий, 0,05% ксилен цианол). Полученные образцы инкубировали 3 мин при 100^оС, быстро охлаждали до 0^оС и отбирали по 2 мкл для электрофореза в денатурирующем полиакриламидном геле, имеющем состав:

6% акриламид,

8 М мочевина,

1-кратный глицерин-толерантный буфер (1,1% трис, 0,36% таурин, 0,02% Na₂ЭДТА).

Электрофорез проводили при напряжении 40 В/см. Затем гель выдерживали 30 мин в 10% уксксной кислоте, высушивали и экспонировали 12 часов при комнатной температуре с рентгеновской пленкой (Маниатис и др., 1984).

САУЗЕРН БЛОТ ГИБРИДИЗАЦИЯ

10 мкг геномной ДНК, выделенной из печени стерляди, инкубировали в течение 2 часов с эндонуклеазами рестрикции Pst I и Pvu II (по 50 е.а.) при 37^оС в буфере, содержащем 100 мМ NaCl, 10 мМ трис-HCl, рН 7,5, 10 мМ MgCl₂, 100 мкг/мл бычий сывороточный альбумин, 6 мМ 2-меркаптоэтанол. Затем экстрагировали ДНК последовательно равными объемами фенол-хлороформа (1:1) и хлороформа, осаждали ДНК двумя объемами этанола, растворяли в воде и наносили на 1% агарозный гель. Электрофорез проводили при напряжении 1 В/см и температуре 12^оС в течение 12 часов. Затем гель инкубировали при комнатной температуре 30 мин в 0,25 М HCl, 30 мин в денатурирующем растворе (0,5 М NaOH, 1,5 M NaCl) и 10-15 мин в растворе 1 (0,25 М NaOH, 1,5 M NaCl). После этого ДНК переносили на нейлоновую мембрану методом вакуумного переноса в растворе 1. Мембрану споласкивали в 2-кратном SSC, высушивали и фиксировали ДНК в течение 10 мин ультрафиолетовым излучением с длиной волны 310 нм.

Предгибридизацию проводили при 55^оС в течение 1 часа в растворе 1 (см. Скрининг библиотеки кДНК). Гибридизация длилась 12-16 часов при 55^оС с концентрацией зонда не более 10 нг/мл.

Отмывку проводили два раза по 10 мин в 2-кратном SSC + 0,1% SDS при комнатной температуре и один раз 15 мин в 1-кратном SSC + 0,1% SDS при 55^оС. Экспонирование длилось 12 часов при -70^оС (Маниатис и др., 1984).

РЕЗУЛЬТАТЫ

КОНСТРУИРОВАНИЕ БИБЛИОТЕКИ кДНК И ЕЕ СКРИНИНГ

В качестве источника мРНК брали лейкоциты периферической крови стерляди. На основе этой мРНК синезировали кДНК. Полученные молекулы кДНК клонировали в плазмидном векторе pBluescript KS(+), после чего трансформировали этим вектором клетки E.coli штамма XL-1 Blue MRF’. В результате этого была получена библиотека кДНК представительностью 6 миллионов клонов. Библиотеку амплифицировали до объема 5 х 10¹¹ клеток.

Cуммарную плазмидную ДНК библиотеки выделяли и использовали в ПЦР с парой праймеров, один из которых гомологичнен участку вектора вблизи сайта клонирования молекулы кДНК и располагается в кодирующей ориентации. Второй праймер вырожденный, соответствующий наиболее консервативному участку последовательности J-сегментов L-цепей ИГ позвоночных в некодирующей ориентации (рис. 10).

Один из фрагментов ДНК, полученных в результате ПЦР, соответствовал ожидаемому размеру (370 пн). Этот фрагмент выделяли и субклонировали в векторе pBluescript KS(+). Определение нуклеотидной последовательности этого фрагмента показало, что он гомологичен генам V области L-цепей ИГ (Рис. 11).

Этот фрагмент был использован в качестве зонда для скрининга библиотеки кДНК лейкоцитов стерляди. Скрининг 4000 колоний библиотеки кДНК в мягких условиях гибридизации позволил выявить пять клонов с размером вставки кДНК от 800 до 1050 пн. Для четкого разделения клонов проводили вторичный скрининг библиотеки кДНК, после чего выделенные клоны амплифицировали.

прамер Т3

5'-GCAATTAACCCTCACTAAAGG-3';

J-праймер

5'-A(G/C)(T/C)(T/C)TGGT(T/G/C)CCTTTTCC(A/G)AA-3’

Рис. 10. Схема ПЦР. Т3 праймер располагается вблизи сайта клонирования молекулы кДНК и комплиментарен некодирующей цепи, J-праймер гомологичен участку кодирующей цепи J-сегмента генов L-цепей ИГ позвоночных. Ожидаемая длина продуктов около 400 пн.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПЕРВИЧНОЙ СТРУКТУРЫ

Определена нуклеотидная последовательность вставки кДНК клона В1. кДНК клона В1 размером 1050 пн представляла собой полноразмерную копию зрелого гена L-цепи ИГ и содержала 5’-нетранслируемую область, последовательность кодирующую лидерный пептид, V область, С область, а также 3’-нетранслируемую область (Рис. 11). На основе первичной структуры клона В1 сконструировали и синтезировали три праймера, соответствующих консервативным районам V и C области и использовали их для определения нуклеотидной последовательности клонов Е4 и С2. Последовательность клона Е4 была определена только в области, примыкающей к Т3 промотору вектора. За исключением 2 нуклеотидов она полностью идентична последовательности В1. Последовательность клона С2 имела химерный характер. В области Т3 промотора она содержала фрагмент соответствующий 3’ части С сегмента клона B1 с заменами нескольких нуклеотидов. В то же время использование для определения последовательности праймеров V и C области показало, что эта вставка содержит дополнительно перестроенный ген легкой цепи, содержащий большую часть V сегмента и второй С сегмент, отличающийся от первого в одной позиции. Поскольку пока не удалось определить последовательность в области стыка этих двух фрагментов вставки, нельзя сказать, находятся ли они в одной или разных ориентациях. По-видимому, сходный химерный характер имеет последовательность клона D2 (данные не показаны).

СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ПЕРВИЧНОЙ СТРУКТУРЫ

Нуклеотидную и предсказанные аминокислотные последовательности клона В1 сравнивали с последовательностями V и C генов L-цепей ИГ других видов позвоночных (Рис 12). На аминокислотном уровне V область имеет наибольшее сходство с V-областями L-цепей класса F и G пещерного сомика и с V-областью L1 класса ИГ форели (63-71%). И те и другие относятся к каппа-типу L-цепей. При поиске гомологов в полном банке последовательностей ИГ млекопитающих первые 100 позиций с наибольшим сходством представляли собой также V каппа области.

С-область клона В1 имеет на аминокислотном уровне приблизительно одинаковое и не очень значительное сходство с широким спектром С-областей L-цепей ИГ хрящевых и костистых рыб (41-44%). На нуклеотидном уровне наиболее близкими гомологами В1С гена являются гены III класса хрящевых рыб (65%).

АНАЛИЗ ГЕНОМНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ

Геномную организацию локуса генов L-цепей ИГ стерляди оценивали методом Саузерн блот гибридизации. Геномную ДНК выделяли из печени стерляди. ДНК расщепляли эндонуклеазами рестрикции Pst I и Pvu II. После электрофоретического разделения и переноса фрагментов ДНК на нитроцеллюлозную мембрану проводили гибридизацию в мягких условиях. В качестве зонда на V-гены использовали фрагмент, полученный в результате ПЦР (см. Конструирование библиотеки кДНК и ее скрининг). В качестве С-зонда использовали участок кДНК клона В1, кодирующий C_L сегмент, который вырезали по сайтам рестрикции эндонуклеазами EcoR V-Xho I.

V-зонд выявлял более 20 гибридизующихся фрагментов ДНК, в то время как С-зонд гибридизовался только с 3-4 фрагментами (рис. 13).

5' нетранслируемая область |> лидерный пептид

1 15 30 45 60 75 90

B1 . .TTCATGGCAACA GAATCCACAACAACA ATGACTTTTATCAGC ATCTTCATCTGGGCA CTTGTCATCTGCACT CAGGAATCCAGTGGA

E4 CCC----A------- --------------- --------------- --------------- --------------- ---------------

C2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

C2(T3) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

|> V сегмент FR 1 |> CDR 1

105 120 135 150 165 180

B1 CAGTATACTGTGACT CAGACTCCAGCAGAG AAATCTGTTCTCCCA GGAGACACAGTCGCT CTCAACTGTAAAGTC AACAGCGCAGTCCTT

E4 --------------- --------G----T- --------------- ----------. . . . . . . . . . . . . . . . . . .

C2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

C2(T3) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

|> FR 2 |> CDR 2 |> FR 3

195 210 225 240 255 270

B1V GGTAATACGTACCTG CACTGGTACCAACAG AAACCTGGAGAAGCT CCCAAACTCCTGATC TATAGGGCAAGTACC CTTGAGTCTGGGATC

E4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

C2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ---- ---C-----------

C2(T3) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . .------------ -----------A--- ---TAT----T--AG ---C-------N---

285 300 315 330 345 360

B1 CCAACTCGTTTCAGT GGCAGTGGATCTGGG ACTGACTTCACTCTG ACCATCAGTGGAGTC CAGGCTGAAGATGAA GGAGATTACTACTGT

E4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

C2 --------C----C- --------------- --------------- --------------- --------------- --------T------

C2(T3) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

PCR --------------- ------------TT- --------------- --------------- -------------C- ---------------

|> CDR 3 |> J сегмент |> С сегмент

375 390 405 420 435 450

B1 GTCAGTGTACACTAC TCCAGCAGTAGATAT GTGTTGACTTTCGGG CCCGGGACCAAACTA ATTGTGAAATCTGGA AGCCCCACTGCTCCT

E4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

C2 CAG---TC------- C----------C-G- -NCC-C--------A --A--------G--G G-------------- -A-------------

C2(T3) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

PCR CAG---CAC---ACT C---ATG . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

465 480 495 510 525 540

B1 TCCTCCGTCTCCCTG CTTCCTCCCTCCAAG CTGGAGCTCGACTCA AAGGGTAAAGCCACC CTGGTCTGCCTGGTG AATAATTTCTACCCT

E4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

C2 --------------- --------------- ------------A-- -----C--------- TG------------- --------------C

C2(T3) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . -C--------- T-------------- --------------C

PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

555 570 585 600 615 630

B1 GATGTCGTGGATATC AAGTGGACGGTGGAC GGGGTGGCCCAGTCG TCTGGTGTGCTGACC AGCACAATGAAGCAG AAGGATGGGAAATAC

E4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

C2 --------------- --------------T ----C---------- --------------- --------------- -----C---------

C2(T3) --------------- --------------T ----C---------- --------------- --------------- -----C---------

PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

645 660 675 690 705 720

B1 AGTGCAAGCAGCAGC CTGACCCTCACCAAG GCCGTGTGGAACAGC AAGGAGACATACACC TGCACTGTGAAGCAC GAGGCTGTGAGCACT

E4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

C2 --------------- --------------- -A------------- --------------- --------------- ---------------

C2(T3) --------------- --------------- -A------------- --------------- --------------- ---------------

PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

|> 3' нетранслируемая область

735 750 765 780 792

B1 CCCAGGAGCGAGTCC ATCAAGAGGAGCGAG TGCACACTATTAGAT GCCtaaAGG . . . . . . . . .

E4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

C2 --G----------T- --------------- --------------- ---taaG-CAAGAGA ATCCGTGTGATT

C2(T3) --G----------T- --------------- --------------- . . . . . . . . . . . . . .

PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Рис. 11. Нуклеотидная последовательность полноразмерной кДНК клона В1 и частичная последовательность кДНК клонов Е4 и С2 и продукта ПЦР. Последовательность кДНК клона С2 определялась с использование праймеров V1, V2, C1 (обозначение С2) и Т3 (обозначение С2(Т3)). Прочерк означает идентичность в этой позиции с кДНК клона В1, FR - каркасные участки, CDR - гипервариабельные участки V области.

A

AruIgLBV QYTVTQTPAEKSVLPGDTVALNCKVNSAVLGNTYLHWYQQKPGEAPKLLIY*RASTLESGIPTRFSGSG**SGTDFTLTISGVQAEDEGDYYCVSV

IpuIgLVG -V-------V--A---E--TI--RT-P-Y*-H*-----------------K*F-NQ-H----A------**--S----------T--A-----Q-Y 71%

OmyIgLV1 -I------EM-AFQT--A-T-R-RF-KPSPPC**VA-------G--Q----*Y-T--Q--T-S------**--S-------------A-----Q-Y 63%

XIaIgLVR -VVL--S-DYV--S--E--TIT--AS-SS---**-------S-QT------*GT-NRYT-T-E------**----------RME---AA----QQY 58%

Rabbit kV IV ivm----ss---pv----ti--qasqs-ys-nr-a-f-----qp------*k----a--v-s--k---**---q------d--ca-aat---rva 57%

GciIgLVIII -M--S-PVL--GL-Q--TIT-TASQS-YS-**-A----RE-QK-S----*A-TNRYTEVSE------**---S-----RN--P--VA----QGT 48%

HulV2 -SAL--*-ASV-GS--QSITIS-TGT-SSYNL**VS----H--K----M--*EG-KRP--VSN-----K**--NTAS--T--L-----A----C-Y 47%

HfrIgLVII GTVL--*--SM-TSQ-K--KIT-TISGGGTYY**SS--W----S--VFVWRDYD--RG----D--T--RNT-SNVMH---TD--SR-TA-----AW 41%

XlaIgLIII -VSI--*-VSE--KL-E--RIS-TLSG-SGYH**VN-----A-NR-RY-LRFYSDSNK**HQD-----KDSPNNIGY---K-ALL--DA----ATW 35%

HfrIgLV1 VPVLN---ISDP-SA-E-SE-K-AMQNGGSYY**MS--R-R-----VFVL**YQ--SG-IYRD--KP-RDT-SNSHI---GSLEPG-SAV---AAN 31%

Б

AruIgLCB GSPTAPSSVSLLPPSKLELDSKGKATLVCLVNNFYPDVVDIKWTVDGVAQSSG*VLTSTMKQK**DGKYSASSSLTLTKAVWNSKETYTCTVKHEAVSTPRSESIKRSECTLLDA

CplIgLCII -RS*PT--V----SDQITA-NM-------SG-V-GAAE-E-----SVRGN-*-E--RIQ-EA*-NTF-V--Y---SASD---H-L-S-V-K-ETQAN-LQT--S--S-M 44%

HfrIgLCIII EKSQPTLT-M---PE-VKA--T------ADH----E-GVE-KK--A-I-A-*-Q--NYLRAS*-ST--C--L---SGSD-E-NARFS-ALT-ETL-S-L-K-VS----V 42%

IpuIgLCF G--VKP-----L--S-Q-S*E-S-S-L--LPAYS-QGALVS-----SEVKD-*----AEER-**TDG-TR--T---S--L-EKG-EFV-K-S-DN-DH-VT**FRK-Q-EV 41%

Hu kappa TV-AP-VFIF---*D-QLKS-T-SV---L-----REAKVQ-K--NAL--GN*SQE-VTE-DSK-ST--L--T---S--DYEKHKV-A-E-T-QGL-S-VTK-FN-G-- 39%

XlaIgLC3 GDVK--*---YF---*V-EIATK---V--SLSD-T-RGATVK-L---KD-TDS*-QS-GLSKQS*-NL-ME--Y-S--ADQ-LRH---S-K-S-Q**GKEIIQTL-----V 38%

Hu lambda1 Q-K-NPT-T-F---*S-ELQAN-------ISD---GA-TVA-KA--SPVKA-*-E-TKPSKQS*NN--A---Y-S--PEQ-K-HRS-S-Q-T-E**GSTVEKTVAPT--S 37%

HfrIgLCI SEDRKP-VL-----*S-EIDS-W---S---SR-K-GF-RVL-R--DKETD--*-T-G-VSTDS*-QS--L--YLRVPATA--KGSS---S-D-GSL-S-LLKT-SSTA-SD 37%

XlaIgLCS ND-KPA-FIFK--*D-QVKE-NP-A---I---F-RDLTVT-K--SQDV--SD-K--DFM-ES*-ST--Q--M-T---DK-DKADKFE-L-K-K**TAQLTQSFSK-Q-S 34%

IpuIgLCG LTQP--TV----SV--Q*QE-V-----AYKGF-SDWRLS-K---SSW---*ESR-SAVLQA*--L--W--T-S-HPEQ-RN-*VV--EASKDN*QP-VVSTVNTEQ- 33%

Рис. 12. Сравнение аминокислотных последовательностей V (А) и С (Б) областей L-цепи ИГ стерляди с последовательностями других видов позвоночных. Дефис обозначает идентичность в данной позиции. Звездочка обозначает делецию аминокислотных остатков. Слева указаны проценты сходства. Видовые обозначения: Aru - стерлядь, Ipu - пещерный сомик, Omy - радужная форель, Xla - шпорцевая лагушка, Gci - акула-нянька, Hu - человек, Cpl - песчаная акула, Hfr - разнозубая акула.

Рис. 13. Саузерн блот гибридизация. Геномная ДНК была выделена из печени и обработана эндонуклеазами рестрикции Pst I Pvu II. Гибридизацию проводили в мягких условиях с использованием зондов, гомологичных V_L (а) и C_L (б) генным сегментам L-цепей ИГ стерляди. С V-зондом гибридизовалось более 20 фрагментов ДНК, в то время как с С-зондом гибридизовалось только 3-4 фрагмента.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В результате проведенной работы идентифицирован локус генов, кодирующих L-цепи ИГ стерляди, представителя подкласса костно-хрящевых рыб. Сравнительный анализ структуры V генов этого локуса указывает, что он относится к каппа типу. Результаты сравнительного анализа С областей менее информативны, что само по себе не удивительно, так как С-гены L-цепей ИГ значительно менее консервативны чем V-гены. Тем не менее, тот факт, что на нуклеотидном уровне С-ген стерляди имеет наибольшее сходство с каппа-подобными генами III класса хрящевых рыб, также свидетельствует о том, что обнаруженный локус относится к каппа типу.

кДНК клонов В1, С2, Е4, а также фрагмент, полученный с помощью ПЦР, содержат близкородственные V-гены. Различия между ними сконцентрированы в основном в области 3-го гипервариабельного района. Последовательности двух обнаруженных J-сегментов отличаются по 10 нуклеотидам, т.е., они представляют собой различные геномные сегменты. Незначительные различия обнаружены также между тремя последовательностями С-генов. С-сегмент клона В1 отличается от полного С-сегмента клона С2 по 9 позициям, из которых 5 ведут к замене аминокислоты. По-видимому, эти последовательсти также представляют собой разные зародышевые гены.

Анализ структурной организации локуса с помощью Саузерн блот-гибридизации указывает, что у стерляди имеются множественные V_L гены. Точная оценка их количества невозможна, но наличие более 20 полос гибридизации с разной интенсивностью сигнала, по аналогии с многочисленными литературными данными, позволяет говорить о нескольких десятках копий.

При использовании С-зонда количество полос в мягких условиях гибридизации не превышает 4-х. Учитывая возможность аллелизма можно говорить о наличии в этом локусе 2-4х генов.

Ярко выраженное количественное превосходство V генов над С-генами является характерным признаком сегментарной формы организации локуса. У хрящевых и костистых рыб с кластерной организацией генов L-цепей количество V и С генов очень велико и приблизительно одинаково, что отражается в сходной картине блот-гибридизации. Полученные нами результаты являются серьезным основанием для того, чтобы утверждать, что у стерляди организация генов L-цепей каппа-подобного типа имеет сегментарный характер, подобный организации каппа локуса млекопитающих.

Эти данные указывают на то, что переход от кластерной к сегментарной организации произошел в филогенезе позвоночных очень рано, возможно уже у древних первично-костных.

ВЫВОДЫ

1. Сконструирована библиотека кДНК лейкоцитов стерляди представительностью 6х10⁶ независимых клонов. ПЦР ДНК библиотеки с помощью вырожденного праймера, соотвествующего J сегменту генов ИГ, позволил выявить фрагмент ДНК длиной 370 пн, гомологичный V генам ИГ позвоночных.

2. Из библиотеки кДНК с использованием продукта ПЦР в качестве зонда выделено пять клонов, содержащих вставки кДНК генов L-цепей ИГ. Сравнительный анализ первичной структуры кДНК клонов показал, что они являются членами одного семейства генов и имеют наибольшее сходство с генами каппа типа.

3. Согласно результам геномного блот-анализа идентифицированное семейство содержит несколько десятков V генов и только 2-4 С гена, что указывает на сегментарную форму его организации.

4. Полученные данные указывают что переход от кластерного типа организации генов ИГ, характерного для хрящевых рыб, к сегментарному, присутствующему у всех млекопитающих, произошел в эволюции в период появления первично-костных рыб.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Мазин А. В., Кузнеделов К. Д. и др. Методы молекулярной генетики и генной инженерии. Новосибирск, 1988. 333 с.

Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984. 480 с.

Пол У. (ред.) Иммунология. М.: Мир, 1987. Т. 1. 476 с.

Ромер А. С. и Парсонс Т. С. Анатомия позвоночных. М.: Мир, 1992. 358 с.

Фримель Г. (ред.) Иммунологические методы. М.: Медицина, 1987. 472 с.

Юдкин И. И. Ихтиология. Москва-Ленинград: Пищепромиздат, 1941.

Aguilera R. J., Akira S., Okazaki K.,Sakano H. A pre-B cell nuclear protein wich specifically interacts with the immunoglobulin V-J recombination sequeces // Cell. 1987. V. 51. P. 909-917.

Anderson M. K., Shamblott M. J., Litman R. T., Litman G. W. Generation of immunoglobulin light chain gene diversity in Raja erinacea is not associated with somatic rearrangement, an exception to a central paradigm of B cell immunity // Journal of Experimental Medecine. 1995. V. 182. P. 109-119.

Bengten E. The immunoglobulin genes in Atlantic cod (Gadus morhuna) and rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) // Dissertations from the Faculty of Science and Technology. 1994. V. 19.

Bengten E., Leanderson T., Pilstrom L. Immunoglobulin heavy chain cDNA from Atlantic cod (Gadus morhuna L.): nucleotide sequences of secretory and membrane form show an unusual splicing pattern // European Journal of Immunology. 1991. V. 21. P. 3027-3033.

Blomberg B., Tonegawa S. DNA sequences of the joining regions of mouse l light chain immunoglobulin genes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1982. V. 79. P. 530.

Boyle J. S., Lew A. M. An inexpensive alternative to glassmilk for DNA purification // Trends in Genetics. 1995. V. 11. No. 1. p. 8.

Chomczynski P. and Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinum thiocyanate-phenol-chloroform extraction // Analytical biochemistry. 1987. V. 162. P. 156-159.

Daggfeldt A., Bengten E., Pilstrom L. A claster type organization of the loci of the immunoglobulin light chain in Atlantic cod (Gadus morhuna L.) and rainbow trout (Oncorhynchus mykiss Walbaum) indicated by nucleotide sequences of cDNAs and hybridization analysis // Immunogenetics. 1993. V.38. P. 199-209.

Dieffenbach C. W. and Dveksler G. S. (edit). PCR primer. A laboratory manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995. 714 p.

Durdik J., Moore M. W., Selsing E. Novel k light-chain gene rearrangements in mouse l light-chain-producing B limphocytes // Nature. 1984. V. 307. P. 749-752.

Flajnik M. F. The immune system of ectothermic vertebrates // Veterinary Immunology and immunopathology. 1996. V. 54. P. 145-150.

Ghaffari S. H. and Lobb C. J. Structure and genomic organization of immunoglobulin light chain in the channel catfish // The Journal of Immunology. 1993. V. 151. P. 6900-6912.

Gilbert W. Evolution of antibodies: the road not taken // Nature. 1990. V. 320. P. 485.

Greenberg A. S., Steiner L.,Kasahara M., Flajnik M. F. Isolation of a immunoglobulin light chain cDNA clone encoding a protein resembling mammalian k light chains: Implications for the evolution of light chains // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. V. 90. P. 10603-10607.

Haire R. N., Ota T., Rast J. P., Litman R. T., Chan F. Y., Zon L. I., Litman G. W. A third Ig light chain gene isotype in Xenopus laevis consists of six distinct VL families and is related to mammalian l genes // The Journal of Immunology. 1996. V. 157. P. 1544-1550.

Hesse J. E., Lieber M. R., Mizuuchi K., Gellert M. V(D)J recombination: the functional difinition of the joining signals // Genes Dev. 1989. V. 3. P. 1053-1061.

Hieter P. A., Hollis G. F., Korsmeyer S. J., Waldmann T. A., Leder P. Clastered arrangement of immunoglobulin l constant region genes in man // Nature. 1981. V. 294. P. 536.

Hieter P. A., Maizel J. V., Leder J., Leder P. Evolution of human immunoglobulin k J region genes // J. Biol. Chem. 1982. V. 257. P. 1516.

Hohman V. S., Schluter S.F., Marchalonis J. J. Complete sequence of a cDNA clone specifying sandbar shark immunoglobulin light chain: Gene organization and implications for the evolution of light chains // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. V. 89. P. 276-280.

Hohman V. S., Schuchman D. B., Schluter S.F., Marchalonis J. J. Genomic clone for sandbar shark l light chain: Generation diversity in the absence of rearrangement // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. V. 90. P. 9882-9886.

Hsu E., Lefkovits I., Flajnik M., Pasquier L. D. Light chain heterogeneity in the amphibian Xenopus // Molecular Immunology. 1991. V. 28. P. 985-994.

immunoglobulin genes and the antibody repertoire // Molecular Biology Evolution. 1993. V. 10(1). P. 60-72.

Litman G. W., Rast J. p., Shamblott M. J., Haire R. N., Michele H., Roess W., Litman R. T, Hinds-Frey K. R., Zilch A., Amemiya C. T. Phylogenetic diversification of Lobb C. J., Olson M. O. J., Clem W. L. Immunoglobulin light chain classes in a teleost fish // The Journal of Immunology. 1984. V. 132. P. 1917-1923.

Lundqvist M., Bengten E., Stromberg S., Pilstrom L. Ig light chain gene in the siberiah sturgeon (Acipenser baeri) // The Journal of Immunology. 1996. V. 157. P. 2031-2038.

Maisey J. G. Chondrichthyan phylogeny: a look at the evidence // J. Ven. Paleont. 1984. V. 4. P. 359-371.

Rast J. P., Anderson M. k., Ota T. Litman R. T., Margittai M., Shamblott M. J., Litman G. W. Immunoglobulin light chain class multiplisity and alternative organizational form in early vertebrate philogeny // Immunogenetics. 1994. V. 40. P. 83-89.

Reynaund C. A., Anquenz V., Grimal H., Weill J. C. A hyperconversion mechanism generates the chicken light chain preimmune repertoire // Cell. 1987. V. 48. P. 379-388.

Roitt I., Brodstoff J., Male D. Immunology. London: Mosby-Year Book Europe, 1993.

Romer A. S. Vertebrate Paleontology. Chicago: University Chicago Press, 1966.

Sakano H., Huppi K., Heinrich G., Tonegawa S. Sequences at the somatic recombination sites of immunoglobulin light-chain genes // Nature. 1979. V. 280. P. 288.

Sakano H., Maki R., Kurosawa Y., Roeder W., Tonegawa S. Two types of somatic recombination are necessary for the generation of complete immunoglobulin heavy-chain genes // Nature. 1980. V. 286. P. 676.

Sanger F., Niklen, S., Coulson A.R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 1977. V. 74. P. 5463-5467

Schatz G. D., Oettinger A. M., Schlissel M. S. V(D)J recombination: molecular biology and regulation // Annual Review of Immunology. 1992. V. 10. P. 359-383.

Schwager J., Burckert N., Schwager M., Wilson M. Evolution of immunoglobulin light chain genes: analysis of Xenopus IgL isotypes and their contribution to antibody diversity // The EMBO Journal. 1991. V. 10. P. 505-511.

Seidman J. G., Max E. E., Leder P. A. A k immunoglobulin gene is formed by site - specific recombination without further somatic mutation // Nature. 1979. V. 280. P. 370.

Shamblott M. J. and Litman G. W. Genomic organization and sequences of immunoglobulin light chain genes in a primitive vertebrate suggest coevolution of immunoglobulin gene organization // The EMBO Journal. 1989. V. 8. P. 3733-3739.

Shankey T.V. and Clem L.W. Phylogeny of immunoglobulin structure and function. IX. Intramolecular heterogeneity

of shark 19S IgM antibodies to the dinitrophenyl hapten //

J. Immunol. 1980. V. 125. P. 2690-2698.

Stavnezer J., Kekish O., Batter D., Grenier J., Balazs I., Henderson E., Zegers B. J. Aberrant recombination events in B cell lines derived from k-deficient human // Nucl. Acids Res. 1985. V. 13. P. 3495-3514.

Stewart S. E., Pasquier L. D., Steiner L. A. Diversity of expressed V and J regions of immunoglobulin light chains in Xenopus laevis // European Journal of Immunology. 1993. V. 23. P. 1980-1986.

Strob U. Transgenic mise with immunoglobulin genes // Annual Review of Immunology. 1987. V. 5. P. 151-174.

Thompson G. B. and Neiman P. E. Somatic diversification of the chicken immunoglobulin light chain gene is limited to the rearranged variable gene segment //Cell. 1987. V. 48. P. 369-378.

Tonegawa S. Somatic generation of antibody diversity // Nature. 1983. V. 302. P. 575-581.

Udey J. A., Blomberg B. Human l light chain locus: organization and DNA sequences of three genomic J regions // Immunogenetics. 1987. V. 25. P. 63.

Wai Lin Tung, King-C. Chow. A modified medium for efficient electrotransformation of E.coli // Trends in Genetics. 1995. V. 11. No. 4. Р. 128-129.

Wilson M., Hsu E., Marcuz A., Courent M., Pasquier L. D., Steinberg C. What limits affinity maturation of antibodies in Xenopus: the rate of somatic mutation or the abilityto select mutants? // The EMBO Journal. 1992. V. 11. P. 4337.

Zezza D. J., Mikoryak C. A., Schwager J., Steiner L. A. Sequence of C region of L chains from Xenopus laevis Ig // The Journal of Immunology. 1991. V. 146. P. 4041-4047.

Zezza D. J., Stewart S. E., Steiner L. A. Genes encoding Xenopus laevis Ig L chains. Implications for the evolution of k and l chains // The Journal of Immunology. 1992. V. 149. P. 3968-3977.

МИНИСТЕРСТВО ОБЩЕГО И ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО

ОБРАЗОВАНИЯ РФ

НОВОСИБИРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

ФАКУЛЬТЕТ ЕСТЕСТВЕННЫХ НАУК

Кафедра цитологии и генетики

КЛОНИРОВАНИЕ И АНАЛИЗ ГЕНОВ ЛЕГКИХ ЦЕПЕЙ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ СТЕРЛЯДИ

Дипломная работа

Денисова С. Г.

_____________

Научный руководитель

к.б.н. Таранин А. В.

_____________

Работа выполнена в

лаборатории иммуногенетики

Института цитологии и

генетики СО РАН.

Новосибирск