Значение белков теплового шока при вич-инфекции

На правах рукописи
НАЧАРОВ Петр Васильевич
ПРОГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ БЕЛКОВ ТЕПЛОВОГО ШОКА ПРИ ВИЧ-ИНФЕКЦИИ
14.00.10—инфекционные болезни
АВТОРЕФЕPAT диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук
САНКТ-ПЕТЕРБУРГ
1997
Работа выполнена в Военно-медицинской академии.
Научный руководитель:
доктор медицинских наук Е. И. Змушко.
Научный консультант:
доктор медицинских наук профессор Ю. В. Лобзин.
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук профессор В. В. Иванова, доктор медицинских наук профессор А. Г. Рахманова.
Ведущее учреждение—Российский научно-методический центр но профилактике и борьбе со СПИДом.
Защита диссертации состоится "" ............... 1997 г.
в .... часов на заседании специализированного совета Д 106.03.05
при Военно-медицинской академии (194044, г. Санкт-Петербург, ул. Лебедева, 6).
С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке академии.
Автореферат разослан
1997 г.
Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук профессор Ю. И. Ляшенко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В России вопросы стратегии и тактики борьбы с ВИЧ-инфекцией определены работами В.И.Покровского (1988: 1989; 1993). В.И.Покровский (1987) предсказал грядущий размах распространения ВИЧ-инфекции в стране и внедрил в практическое здравоохранение структуру, предназначенную для борьбы со СПИДом.

В настоящее время ВИЧ-инфекция охватила все страны мира. К середине 1996 года общее количество инфицированных вирусом иммунодефицита во всем мире достигло 27,9 миллионов человек (Рахманова А.Г., 1996).

Несмотря на то, что выполнен беспрецедентно большой объем научных исследований по. проблеме ВИЧ-инфекции, предложены методы лекарственной терапии, позволяющие добиваться временного улучшения состояния больных СПИДом. до настоящего времени не известен ни один достоверный случай выздоровления, поэтому СПИД считают болезнью с летальностью 100%.

Проблема ВИЧ-инфекции усугубляется еще и тем фактом, что с начала девяностых годов ВИЧ все более и более завоевывает основную популяцию населения, в то время как в течение первых десяти лет распространение шло преимущественно среди определенных групп населения, так называемых "групп риска" - наркоманы, гомосексуалисты. проститутки, больные гемофилией (Лобзин Ю.В., Казанцев А.П.. 1996).

Актуальность проблемы определяет неуправляемое интенсивное возрастание случаев инфицированности, болезненности и смертности во всех странах мира (Шувалова Е.П., 1995). Выявление ВИЧ-инфицированных лиц не приводит к прекращению передачи ВИЧ от них, несмотря на уведомление их об уголовной ответственности за заражение (Покровский В.В. с соавт., 1996). Не решенными остаются основные проблемы СПИДа (Белозеров Е.С. с соавт., 1995):

- отсутствие методов ранней диагностики:

- полная неуправляемость патологических процессов у заболевшего:

- отсутствие надежных клинических и лабораторных показателей перехода инфекционного процесса из латентной стадии в манифестную.

При СПИДе и ВИЧ-инфекции достаточно хорошо изучены основные лабораторные диагностические показатели, свидетельствующие об инфицированности (Змушко Е.И. с соавт., 1996). Однако вопросы прогнозирования клинического течения ВИЧ-инфекции требуют дальнейшего изучения. Наибольшее клиническое значение имеет прогноз перехода от бессимптомной фазы к персистирующей генерализованной лимфаденопатии (ПГЛ), а также от ПГЛ к стадии вторичных заболеваний, который важен для своевременного назначения этиотропных и патогенетических средств (Рахманова А.Г.. Чайка Н.А., 1989).

При поиске новых тестов, которые давали бы представление о состоянии иммунокомпетентных клеток крови при ВИЧ-инфекции, обратила на себя внимание группа сравнительно недавно открытых внутриклеточных белков, получивших название "белки теплового шока" (БТШ) или "стрессовые белки". Эти белки недостаточно изучены, но уже имеющиеся данные говорят, что они высоко консервативны в процессе филогенеза (Lindqulst S., 1986), необычно полифункциональны - играют важную роль во многих внутриклеточных иммунобиохимических процессах как в экстремальных, так и в нормальных условиях (Polla B.S., 1988), что позволяет предположить об участии белков теплового шока в формировании патобиохимических внутриклеточных связей при ВИЧ-инфекции.

В ответ на воздействие неблагоприятных факторов, в том числе и вирусной инфекции, формируется неспецифическая клеточная реакция, которая сопровождается усилением процессов свободнорадикального окисления (Иванова В.В. с соавт., 1992: 1996), синтезом белков теплового шока (Kaufman S.H.E.. 1990) и является одним из механизмов дестабилизации генома клеток-мишеней. В этих условиях немаловажной представляется роль фермента ксантиноксидазы, которая служит генератором свободных радикалов при ряде патологических состояний клетки и является наиболее значимой среди прооксидантных систем, характерных для лимфоидной клетки (Кожемякин Л.А. с соавт.. 1992).

Отсутствие в литературе данных по комплексной оценке процессов дестабилизации генома, сопряженных с активностью свободнорадикального окисления и системы ксантиноксидазы в иммунокомпетентных клетках крови в динамике развития ВИЧ-инфекции не позволяет определить значимость названных показателей для прогноза клинического течения болезни.

Цель исследования: дать оценку возможности использования показателей белков теплового шока семейства БТШ-70 и комплекса биохимических изменений в мононуклеарах периферической крови в прогнозировании клинического течения ВИЧ-инфекции.

Для достижения указанной цели необходимо было решить следуюие задачи:

1. Изучить динамику традиционных показателей иммунного стату-а у ВИЧ-инфицированных и определить их прогностическую значимость при переходе клинического течения болезни из одной стадии в другую.

2. Изучить изменения активности ксантиноксидазы, интенсивности процессов свободнорадикального окисления и показателей нестабильности генома мононуклеаров периферической крови при ВИЧ-инфекции и оценить их прогностическую значимость.

3. Разработать методические подходы к созданию иммунологического метода для количественного и качественного анализа белков семейства БТШ-70.

4. Изучить показатели белков семейства БТШ-70 в мононуклеарах периферической крови на разных фазах ВИЧ-инфекции.

5. Определить взаимосвязь изменений белков семейства БТШ-70 и комплекса биохимических показателей дестабилизации генома. свободнорадикального окисления и системы ксантиноксидазы мононуклеаров периферической крови у больных в динамике заболевания и оценить их значимость для прогноза клинико-манифестных форм ВИЧ-инфекции.

Научная новизна:

1. Впервые установлено, что нарастание накопления конститутивной изоформы белков семейства БТШ-70 в мононуклеарах периферической крови ВИЧ-инфицированных пропорционально степени выраженности клинических проявлений болезни.

2. Показана связь изменения показателей белков семейства БТШ-70 с уровнем нестабильности генома, активностью процессов свободнорадикального окисления и системы ксантиноксидазы в мононуклеарах периферической крови у больных ВИЧ-инфекцией в процессе развития клинической картины заболевания.

3. Установлено, что изменение состояния белков семейства БТШ-70 в мононуклеарах периферической крови адекватно отражает вероятность перехода ВИЧ-инфекции из бессимптомной фазы в фазу персистирующей генерализованной лимфаденопатии и от персистирующей генерализованной лимфаденопатии к стадии вторичных заболеваний.

4. Установлено, что ВИЧ-инфекция вызывает нарушение реакции белков теплового шока (БТШ-70) мононуклеаров периферической крови в ответ на повреждающие воздействия (гипертермия. ультрафиолетовое облучение).

Практическая значимость работы.

Комплекс показателей, отражающих состояние системы белков теплового шока, системы ксантиноксидазы, процессов свободнорадикального и нестабильности генома мононуклеаров периферической крови, в совокупности с традиционными иммунологическими показателями может быть использован для прогнозирования перехода клинического течения ВИЧ-инфекции из бессимптомной фазы в фазу ПГЛ и от ПГЛ к стадии вторичных заболеваний.

Изучение показателей белков теплового шока мононуклеаров периферической крови человека как защитного механизма неспецифического действия может может быть применено для оценки эффективности лекарственных средств с иммуномодулирующими свойствами, а также для разработки новых диагностических подходов к прогнозированию иммунодефицитных состояний различной этиологии.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Переход клинического течения заболевания от бессимптомной фазы к персистирующей генерализованной лимфаденопатии (ПГЛ) и от ПГЛ к стадии вторичных заболеваний характеризуется увеличением содержания конститутивной изоформы семейства БТШ-70 в мононуклеарах периферической крови.

2. Изменения содержания белков семейства БТШ-70 в процессе ВИЧ-инфекции происходят на фоне увеличения показателей нестабильности генома, интенсификации процессов свободнорадикального окисления и повышения активности ксантиноксидазы в мононуклеарах периферической крови.

3. Показатели белков семейства БТШ-70 мононуклеаров периферической крови в совокупности с традиционными иммунологическими показателями возможно использовать для прогнозирования перехода клинического течения ВИЧ-инфекции из бессимптомной фазы в фазу персистирующей генерализованной лимфаденопатии (ПГЛ) и от ПГЛ к стадии вторичных заболеваний.

Апробация работы.

Результаты исследований доложены на XI-й и XII-й научных конференциях молодых ученых академии (ВМедА, Ленинград, 1990; ВМедА, Санкт-Петербург, 1992), на

VI-м Всесоюзном биохимическом съезде (Санкт-Петербург, 1992), на Первой международной региональной конференции по ВИЧ-инфекции "Социальные и медицинские проблемы СПИДа" (Санкт-Петербург, 1994). на заседании Санкт-Петербургского отделения Российского научного общества инфекционистов (Санкт-Петербург, 1996), на IV международной конференции "СПИД, рак и родственные проблемы" (Санкт-Петербург. 1996), на III Всероссийском съезде гематологов и трансфузиологов (Санкт-Петербург. 1996). Материалы диссертации использованы в отчетах по теме НИР N 50-93-В12 "Биохимические механизмы формирования иммунодефицитов под влиянием ВИЧ и иммунодиагностика иммунодефицитных состояний больных СПИДом" и по теме НИР N 60-95-П4 "Исследование роли системы белков теплового шока в патогенезе ВИЧ-инфекции".

Реализация результатов работы.

По теме диссертации опубликовано 7 научных работ. Результаты работы используются в практике учебного процесса и научно-исследовательской работе кафедры инфекционных болезней, кафедры клинической биохимии и лабораторной диагностики, в работе НИЛ СПИДа и инфекционных заболеваний в ВС РФ Военно-медицинской академии, кафедры инфекционных болезней Семипалатинского государственного медицинского института, кафедры ЛОР-болезней с курсом аллергологии и иммунологии Чимкентского государственного медицинского института, кафедры инфекционных болезней Волгоградского государственного медицинского университета.

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 171 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, пяти глав собственных исследований. обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего 61 отечественный и 140 зарубежных источников. Диссертация иллюстрирована 24 рисунками и 17 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Общая характеристика больных и методов исследования

В процессе работы были обследованы 34 инфицированных и больных ВИЧ-инфекцией, среди которых преобладали лица мужского пола в возрастной категории от 20 до 39 лет. Клиническое наблюдение и обследование больных проводили в больнице N 30 имени С.П. Боткина г.Санкт-Петербурга, Республиканской клинической инфекционной больнице г. Усть-Ижоры Ленинградской области, в Центре по борьбе и профилактике СПИДа г.Санкт-Петербурга.

Больные были распределены по группам в соответствии с клинической классификацией В.И.Покровского (1989). Вич-инфицированных в стадии инкубации и больных в терминальной стадии не обследовали. Контрольную группу составили 25 практически здоровых мужчин (доноров крови) в возрасте от 20 до 39 лет - военнослужащие.

Иммунологические и биохимические исследования проводили в Военно-медицинской академии, определение белков теплового шока - на базе института цитологии Академии наук.

Диагноз ВИЧ-инфекции верифицировали серологически - по наличию в крови специфических антител к ВИЧ с помощью тест-систем для гетерогенного иммуноферментного анализа методом двойных антител (производства фирм СП"ДиаПЛЮС". Россия-Швейцария, СП"Авиценна", Россия-Сирия). Результаты иммуноферментного анализа подтверждали с помощью иммуноблотинга ("Du Pont", США).

Для оценки иммунного статуса у обследованных пациентов изучали следующие показатели: количество лейкоцитов, лимфоцитов; субпопуляции Т-лимфоцитов с помощью проточного цитофлюориметра "EPICS-C" (Coulter elektronics. США-Франция) с применением моноклональных антител фирмы "Ortho Diagnostic Systems"(США): РТМЛ с КонА определяли по методу M.George. J.H.Vaughan (1962); количество В-лимфоцитов, несущих Ig M, G, А, определяли методом иммунофлюоресценции с использованием моноспецифических сывороток к иммуноглобулинам человека; концентрации Ig M. G, А, определяли методом радиальной иммунодиффузии в геле (Mancini С. et al.. 1963); содержание циркулирующих иммунных комплексов по методу Ю.А.Гриневича. А.Н.Алферова (1981).

Для исследования системы белков теплового шока в мононуклеарах периферической крови ВИЧ-инфицированных была получена панель поликлональных антител. При иммунизации животных и аффинной очистки антител применяли препарат белков БТШ-70. Для получения препарата БТШ-70 использовали белковый экстракт, полученный из мышечной ткани крупного рогатого скота и клеток культуры HeLa. Выделяли препарат методами ионообменной (с DEAE-сефарозой; и аффинной(с АТФ-агарозой) хроматографии. Чистоту полученных белков БТШ-70 проверяли при помощи электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия. Препарат БТШ-70 имел чистоту около 98% и содержал смесь конститутивной (hsc-70) и индуцибельной (hsp-70) изоформ семейства БТШ-70.

Из иммунной сыворотки кроликов выделяли антитела к БТШ-70 методами высаливания и аффинной хроматографии на колонках со смесью белков hsc-70 и hsp-70. Каждая серия антител подвергалась проверке на специфичность двумя методами - иммуноферментного анализа и иммуноблоттинга. Для определения эпитопов БТШ-70, с которыми реагировали полученные антитела, использовали "сэндвич"-метод иммуноферментного анализа и реакция иммунопреципитации с предварительным мечением белков [35S]-метионином. Иммунопреципитаты были подвергнуты одно- и двумерному электрофорезу (Laemli U.K., 1970; O'Farrel P.H.. 1978). Поликлональные антитела использовали в конструкции иммуноблотинга с последующей денситометрией проявленных зон белков, что позволяло полуколичественно оценивать содержание изоформ семейства БТШ-70 в мононуклеарах периферической крови больных.

Для проверки функционального состояния системы БТШ-70 мононуклеаров периферической крови служили нагрузочные тесты In vitro - тепловой шок (прогрев клеток при 43±0.3° С в водяном термостате) и ультрафиолетовое облучение с использованием прибора МД-73 "Изольда".

Определение активности ксантиноксидазы и ее формы в мононуклеарной фракции крови проводили по методу У.Прайор (1979). Уровень процессов свободнорадикального окисления тотально в мононуклеарах периферической крови и отдельно в их ядрах оценивали по содержанию продуктов, связывающих тиобарбитуровую кислоту, которые определяли по методу M.Uchlyama, M.Michara (1978). В качестве интегральных биохимических показателей нестабильности генома клеток были избраны относительная доля продуктов деградации хроматина - полидезоксинуклеопротеидов, которые являются фрагментами ДНК, (Parks D.A., Granger D.N., 1986) и интенсивность образования однонитевых разрывов ДНК (Birnboim H.C.. Jewcac J.J.. 1981).

Статистическая обработка цифровых данных осуществляли методом вариационной статистики с использованием параметрического критерия (t) Стьюдента. В случае малых выборок использовали непараметрические статистические критерии. Расчеты производили с использованием программы STATGRAF (Statistical Graphics System), версия 2.1.