Навигация
Флуориметрические детекторы
68282
знака
0
таблиц
9
изображений
1.4.4 Флуориметрические детекторы
Детектирование по флуоресценции применяют в биологии, медицине, форма-кологии, при анализе пищевых продуктов и контроле загрязнения окружающей среды. Флуоресцентными свойствами, т.е. способностью излучать свет (в видимой области спектра) под действием ультрафиолетового излучения, обладают многие биологически-активные вещества: лекарства, витамины, стероиды. Красители, соединения с сопряженными связями, в том числе полиядерные ароматические углеводороды, также можно определять с помощью флуориметрического удетектора, при этом чувствительность определения велика.
Интенсивность флуоресцентного излучения зависит от интенсивности возбуждающего излучения и квантового выхода процесса возбуждения. Поэтому для повышения чувствительности метода следует использовать достаточно мощные источники света, например газоразрядные лампы или лазеры. Применение лазеров позволяет детектировать количество вещества на уровне 10-12 г. Метод двухфотонного лазерного возбуждения отдает возможность использовать лазер с более низкой энергией, например, аргоновый. Для внедрения в практику такого метода необходимо иметь достаточно широкий спектр лазеров, перестраиваемых по длинам волн. Чувствительность детекторов по флуоресценции для некоторых соединений оказывается на несколько порядков выше чувствительности детекторов по поглощению, поскольку отсчет удается вести фактически от интенсивности регистриpyeмогo излучения, близкой к нулю, на которую не накладывается возбуждающее излучение.
Разработаны детекторы, которые могут одновременно работать и как спектрофотометры и как флуориметры. Детекторы с монохроматорами, позволяющими выбрать необходимые длины волн для возбуждающего и флуоресцентного излучения, обеспечивают высокую чувствительность и селективность, однако они оказываются значительно более дорогими, чем флуориметры с постоянной спектральной полосой. Одним из надежных флуориметров является детектор «Кратос».
В качестве причин уменьшения чувствительности детекторов следует указать на поглощение излучения при высокой концентрации вещества в ячейке, а также на потерю излучения за счет отражения от окошек ячейки. Поэтому при работе с флуориметром следует использовать достаточно разбавленные растворы, кроме того, возможно применение детекторов без окошек, например с Не—Cd-лазером.
Некоторые нефлуоресцирующие соединения разделяют в виде производных с флуорогенными веществами. Производные получают до хроматографического разделения или после, вводя реагент в Т-образное устройство между колонкой и детектором. Амины и фенолы образуют диазильные производные при взаимодействии с 5-диметил-амино-1-нафтилсульфохлоридом до разделения, а аминокислоты после разделения обрабатывают флуорескамином.
Флуориметр применяют при анализе микропримесей, когда мала концентрация растворенного вещества, подлежащего обнаружению. Хотя динамический диапазон флуориметра достаточно большой (104), его линейный динамический диапазон может быть ограничен для некоторых растворенных веществ относительно узким интервалом концентраций (10-кратным). Для количественного анализа его следует проверять в интересующем интервале концентраций.
Перед количественным измерением необходимо убедиться в отсутствие фоновой флуоресценции, эффектов гашения и проверить отклик детектора на реальный образец.
Кислородосодержащие растворители гасят флуоресценцию, и их так же как и элюенты, поглощающие свет в области возбужденного излучения, нельзя применять. Галогенсодержащие растворители (хлороформ и метиленхлорид) должны быть использованы с осторожностью, так как имеют тенденцию ослаблять флуоресценцию. Если в растворителе нет флуоресцирующих веществ, флуориметр может работать в градиентном режиме. Флуориметр меньше, чем другие детекторы, зависит от изменений температуры или давления. Однако уменьшение температуры или увеличение вязкости некоторых растворителей затрудняет флуоресценцию.
1.4.5 Другие детекторы
Кроме детекторов, описанных выше, для ВЭЖХ используют и другие приборы: электрохимический, инфракрасный, детектор с диодной матрицей, масс-спектрометрический, транспортный с пламенно-ионизационным детектированием, радиоактивный, по диэлектрической проницаемости, электронозахватный, кулонометрический и др. Одни из них обладают высокой селективностью или чувствительностью, другие дают важную качественную информацию. Рассмотрим более подробно некоторые из них.
Рис. 1.14. Электродная ячейка электрохимического детектора: 1 — выход колонки; 2 — к электроду сравнения; 3 — фтороплатовая прокладка; 4 — рабочая камера кюветы; 5 — рабочий электрод; 6 — блок ячейки
Электрохимический детектор. Этот детектор можно применять для анализа всех веществ, обладающих электрохимической активностью, т. е. способ при определенном потенциале окисляться или восстанавливаться, соответственно отдавая или принимая гектроны. В водных растворах эти потенциалы могут быть от +1,2 до -0,8 В (электрод сравнения — хлорсеребряный).
Вещества, содержащие фенольную, индольную или альдегидную группы, способны окисляться при низких потенциалах (0,4—0,7 В), а вещества с нитро- или кетогруппами — восстанавливаться. Так, важные в биологии классы веществ — катехоламины и 5-гидроксииндолы — в этих условиях способны окисляться, отдавая два электрона. При этом и возникает ток в кювете детектора, который затем усиливается амперометрическим детектором.
Электродная ячейка (кювета), схема которой представлена на рисунке 1.14, состоит из двух блоков, разделенных фторопластовой прокладкой с вырезом, представляющим собой рабочую камеру. В центре камеры расположен тонкослойный электрод (анод) из стеклоуглерода. Электрод сравнения размещается на выходе из ячейки. Вместимость рабочей камеры 1 мкл, что позволяет работать с микроколонками.
Электрохимический детектор более селективен при низких потенциалах рабочих электродов. Для 5-гидроксииндолов нужен потенциал 0,5—0,55 В, для катехоламинов — 0.5—0,7В, для пептидов — 0,9—1,2В. Чувствительность и специфичность электрохимического детектора высокие. По чувствительности они не уступают кулонометри-ческим детекторам, хотя окисляющая способность тонкослойных электродов с рабочей поверхностью 2—4 мм2 составляет лишь 1—10% от количества анализируемого вещества. Нижний предел детектирования катехоламинов и 5-гидроксииндолов составляет от 5 до 20 пг введенного в колонку вещества. На рис. 8.15 приведена хроматограмма 5-гидроксииндолов из солянокислого экстракта 0,5 мл плазмы крови.
При работе с электрохимическим детектором необходимо учитывать следующее. Фоновые шумы тем ниже, чем чище используемые реактивы, поэтому фосфаты нужно очищать перекристаллизацией, использовать высокочистую воду и растворители марок «осч» или для ВЭЖХ. Шлифовать поверхности рабочего электрода следует по мере его загрязнения и увеличения шумов не чаще 1 раза в месяц с последующей промывкой его 50%-ным метанолом. Обязательным является хорошее дегазирование растворителей, желательно продувкой гелием.
Электрохимический детектор находит применение в анализе катехоламинов, серотонина, ацетилхолина и их метаболитов, нейропептидов, ряда лекарственных препаратов. Его можно использовать для анализа фенолов, ароматических аминов, тиоспиртов, аскорбиновой кислоты, мочевой кислоты и других веществ в режиме окисления. В режиме восстановления им можно детектировать хиноны, нитросоединения, металлоорганические и другие coединения.
Существуют другие типы ячеек, кроме вышеописанной, в том числе с капающим ртутным электродом, трубчатым электродом, многоэлектродные ячейки и др. УФ-детектор с диодной матрицей. Как уже отмечалось выше, в УФ-детекторах широко распространенных типов используют прохождение через кюветы (как образца, так и сравнительной) монохроматического света. В УФ-детекторе с фильтрами такой свет из линейчатого спектра испускания ртутной лампы вырезается фильтром, а в спектрофотометре — вырезается из широкого спектра испускания дейтериевой лампы с использованием дифракционной решетки. Только в сканирующем спектрофотометре (например, с «прыгающим» зеркалом, используемым в «Милихроме») кювета освещается последовательно несколькими монохроматическими лучами света. В последнее время появилось очень изящное решение, позволяющее получать непрерывно информацию о полном УФ-спектре веществ, проходящих через кювету. В этом случае через кювету проходит полихроматический свет, т.е. весь непрерывный спектр испускания дейтериевой лампы, который после кюветы попадает на дифракционную решетку, где делится на монохроматические пучки, каждый из которых попадает далее на свою фотоячейку (фотодиод), расположенные в ряд или линейку. Отсюда название — детектор с диодной матрицей или диодной линейкой. С каждой такой ячейки можно в любой момент получить информацию о том, как вещество, проходящее через кювету, поглощает свет при данной длине волны. Существуют диодные линейки с разным числом диодов: 8, 32, 64 и более.
Если вывести информацию с каждого диода на самописец, то он запишет столько хроматограмм, сколько есть диодов, каждую при своей длине волны. Каждая такая хроматограмма может быть рассмотрена, рассчитана, исследована в совокупности с любой другой или другими с привлечением математических методов с целью нахождения примесей в пиках, примесей, которые не детектируются при использовании какой-то одной длины волны. Если такой детектор подключить к многоканальному компьютеру, он может вести обсчет хроматограмм, например, при 8 длинах волн. Если используют достаточное число диодов, может быть в любой момент записан полный УФ-спектр вещества в кювете.
Рис. 1.15. Хроматограмма 5-гидроксииндолов из солянокислого экстракта 0,5 мл плазмы крови, полученная на колонке размером 200х3,2 мм с нуклеосилом С18 (5 мкм), подвижная фаза — 0,1 М нитратно-фосфатный буферный раствор с 12% метанола и 0,5 мМ октилсульфата, рН==4,6, расход 0,8 мл/мин, потенциал +0,5 В, проба 50 мкл: 1 — 5-окситриптофан; 2 — 5-оксииндолил-З-уксусная кислота; 3 — N-метилдопамин (стандарт); 4 — серотонин
Вообще можно считать, что детектор с диодной матрицей—это детектор, наиболее приближающийся к универсальному детектору для исследовательской работы. Он позволяет, сняв только одну хроматограмму, получить очень большой объем информации не только количественной, но и качественной. Такие детекторы выпускаются в настоящее время уже несколькими фирмами, и появляются работы по их использованию, особенно там, где объекты исследования достаточно сложны, а объемы проб очень ограничены. Хотя стоимость таких детекторов с полным набором требуемого обслуживающего оборудования (достаточно мощных компьютеров, многоканальных интеграторов, графопостроителей, дисководов с дисками и т.д.) достаточно высока, однако можно ожидать относительно быстрого снижения их цены в будущем и расширения применения в разных областях.
ИК-детекторы. Детекторы, основанные на поглощении в инфракрасной области спектра, в ВЭЖХ применяют сравнительно недавно и в достаточной степени ограниченно. Главной причиной такого положения является несовместимость ИК-детектора с основными растворителями, применяемыми в адсорбционной и обращенно-фазной хроматографии, а также сравнительно невысокая чувствительность. Практически для детектирования можно использовать только некоторые полосы с наиболее высокими молярными коэффициентами поглощения, а в качестве подвижной фазы — главным образом хлорированные углеводороды. В частных случаях, например при детектировании по поглощению карбонильной группы или двойной связи, для работы пригодны очень многие растворители в широком диапазоне полярности — от гексана до ацетонитрила и метанола.
Рис. 1.16. ММР (1, 2) и распределение по составу (1’, 2') сополимеров пиперилена с метилметакрилатом (ММА); продолжительность сополимеризации: 1 ч (1, 1’). 18 ч (2, 2')
Несмотря на эти недостатки, этот детектор имеет несомненные достоинства. Во-первых, он является одновременно универсальным и селективным: при детектировании по поглощению С-Н-связи он обнаруживает практически любые органические вещества, а по поглощению функциональных групп (например, ОН, С=О, С=С и т.д.) - только соединения, содержащие такие группы. Во-вторых, сигнал детектора почти не зависит от молекулярной массы вещества, что существенно облегчает количественную интерпретацию результатов. В-третьих, он может работать при температурах до 150 °С. Все эти особенности обусловливают ценность ИК-детектора для эксклюзионной хроматографии синтетических полимеров.
При исследовании сополимеров ИК-детектор позволяет получить уникальную информацию о композиционной неоднородности, которую зачастую нельзя получить никакими другими методами. На рис. 1.16 приведены результаты исследования двух образцов сополимеров пиперилена с метилметакрилатом. Композиционную неоднородность оценивали по соотношению соответствующих высот на двух хроматограммах, записанных ИК-детектором Миран-1A по поглощению групп С-Н (А,=3,43 мкм) и С=0 (^=5,75 мкм). Первая Хроматограмма отражала общее ММР сополимера, а вторая - распределение метилметакрилата в пределах этого ММР. Хроматограммы снимали на составной колонке размером 2(300Х7,8 мм) с ц-сферогелем (103А+105А) при 40 °С и скорости потока тетрагидрофурана 1 мл/мин. Данные рис. 8.16 наглядно показывают изменение дифференциальных кривых ММР, состава и композиционной неоднородности на начальной и конечной стадиях реакции, которые обусловлены различной реакционной способностью сомономеров. Чувствительность ИК-детектора в оптимальных условиях достигает 10-6—5.10-7 г/мл, т. е. сопоставима с чувствительностью рефрактометра. В последние годы ведутся интенсивные исследования по использованию в качестве детекторов ИК-спектрофотометров с преобразованием Фурье, что позволит повысить их чувствительность примерно на порядок.
Литература:
1. Fitzpatrick F.A., Wanalda M.A., Kaiser D.G. Anal. chem, 1977, v. 49, p. 1032.
2. Dunlap K.L., Sandridge R.L., Keller. Anal. Chem, 1976, v. 48, p. 297.
3. Poole C.F, E. A.J. High Resol. Chromatogr. Commun., 1978, v. 1, p. 83.
4. Denkert M.E. A.J. Chromatogr, 1981, v. 218, p. 31-43.
5. Bartha A.E. A.J. Chromatogr, 1984, v. 303, p. 29-38.
6. Gloor R., Johnson E.L.. Chromatogr. Sci, 1977, v. 15, p. 413-423.
7. Kraak J.C., Jonker K.M., Huber J.F.K.J. Chromatogr, 1977, v. 142, p. 671-680.
8. Wehli A.E. A.J. Chromatogr, 1979, v. 149, p. 199-210.
9. Даванков В.Л. Журн. ВХО им. Менделеева, 1983, т. XXVIII, № 1, с. 25-29.
10.Даванков В.А. в кн. Прикладная хроматография Под ред. К. И. Сакодынского. М, Наука, 1984, с. 24-32.
11.Davankov V.A., Kurganov A. A., Bochkov A. S.fln Advances in Chroma-tographyed. J.C. Giddings E. A. N. Y, M. Dekker, 1983, v. 22, p. 139— 185.
12.Apffel J.A., Alfredson T.V., Major R.E./J. Chromatogr, 1981, v. 206, p. 43-57.
Похожие работы
... щелочноземельных элементов и магния методом ионной высокоэффективной жидкостной хроматографии Разработка и совершенствование методов, позволяющих решать задачи анализа вод- важная проблема аналитической химии. Развитие высокоэффективной жидкостной хроматографии высокого давления стимулировало развитие нового направления в ионообменной хроматографии- так называемой ионной хроматографии. Синтез ...
Высокоэффективная жидкостная хроматография загрязнителей атмосферного воздуха и воздуха рабочей зоны
... psi Обработка данных и составление отчетов с помощью ПО Galaxie TMПриложение МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ. ИЗМЕРЕНИЕ МАССОВЫХ КОНЦЕНТРАЦИЙ АВЕРСЕКТИНА (СМЕСИ ИЗОМЕРОВ) В ВОЗДУХЕ РАБОЧЕЙ ЗОНЫ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ 1. Подготовлены НИИ медицины труда РАМН (Макеева Л.Г., Муравьева Г.В.).2. Разработаны ООО НБЦ "Фармбиомед" (В.Т. Тер-Симонян, ...
... хроматограф с персональным компьютером (8), который осуществляет не только сбор и обработку информации, но и управляет прибором. [11] 3. Колоночный вариант Разделение смеси веществ в жидкостно-жидкостной хроматографии основываются на различии коэффициентов распределения вещества между несмешивающимися растворителями. Коэффициент распределения вещества равен: Кп,н=сп/сн где сп и сн — ...
... Среди специалистов до настоящего времени идут споры о том, какую хроматографию следует считать микроколоночной. какую обычной аналитической, но в меньшем масштабе [57, 58]. Если жидкостная хроматография с использованием поверхностно-пористых (пелликулярных) сорбентов осуществляется на колонках диаметром около 2 мм и даже 1 мм и длиной до нескольких метров, можно ли считать ее микроколоночной ...
0 комментариев