Навигация
Ферментативная иммунохроматография
24156
знаков
0
таблиц
4
изображения
1.2 Ферментативная иммунохроматография
Ферментативная иммунохроматография также потенциально может широко применяться для диагностики на дому и в кабинете врача. Этот метод предназначен для определения гаптенов, которые в настоящее время в основном определяют с помощью конкурентных методов иммуноанализа. Ферментативная иммунохроматография напоминает иммуноанализ с ферментативным усилением, однако между ними есть и существенные отличия.
В методах типа EMIT гаптен и конъюгатгаптен – фермент конкурируют между собой за ограниченное количество антител против определяемого соединения. Связывание конъюгата с антителом приводит к изменению ферментативной активности. В общем случае свободный конъюгат активен, а в комплексе с антителом неактивен. Таким образом, чем больше определяемого соединения находится в образце, тем большая доля конъюгата останется несвязанной и тем более высокой будет ферментативная активность.
В ферментативной иммунохроматографии также используются конъюгат фермента с определяемым веществом и специфические антитела против последнего. Однако в отличие от EMIT здесь определение не связано с изменением активности конъюгата в комплексе с антителом. Принцип метода ферментативной иммунохроматографии представлен на рис. 6.4. Определенный объем пробы смешивают с раствором, содержащим конъюгат фермент – гаптен и соответствующий ферментный реагент. В рассматриваемом примере сопряженным ферментом является пероксидаза из корней хрена, а ферментным реагентом – глюкозооксидаза. Глюкозооксидаза при окислении глюкозы генерирует пероксид водорода – субстрат пероксидазы, в результате чего отпадает необходимость включать в состав наборов нестабильные пероксидные реагенты. Сухую полоску фильтровальной бумаги с иммобилизованными на ней антителами против определяемого вещества помещают в раствор пробы и других реагентов. Реагирующие вещества под действием капиллярных сил поднимаются по полоске вверх. Глюкозооксидаза распределяется по длине полоски равномерно, а высота подъема определяемого вещества и конъюгата зависит от их относительных концентраций. После инкубации в течение нескольких минут полоску переносят в проявляющий раствор, состоящий из глюкозы и хромогенного индикатора. В ходе ферментативной реакции образуется окрашенная зона, высота которой пропорциональна концентрации определяемого вещества в пробе. Следовательно, здесь конъюгат используется только в качестве маркера для определения длины пробега определяемого вещества по полоске, а активность фермента при связывании конъюгата с антителом не изменяется.
Для определения теофиллина с помощью ферментативной иммунохроматографии требуется около 15 мин. Чувствительность, специфичность и точность анализа сравнимы с соответствующими характеристиками метода EMIT. Для проведения анализа не требуется никаких приборов, окрашенная полоска стабильна в течение года при хранении в темноте. Метод можно применять для анализа проб крови, если к первому раствору добавить агент, агглютинирующий эритроциты, например антисыворотку барана. До настоящего времени положительный контроль в таких аналитических системах не применялся.
1.3 Иммуноанализ с самоудерживанием
Для диагностики на дому и в кабинете врача применяется также так называемый иммуноанализ с самоудерживанием. Как и в иммунофильтрации, в нем использованные жидкости остаются в устройстве для анализа, однако в отличие от последнего в ИАСУ нет необходимости в многочисленных стадиях добавления реагентов и промывки. Принцип ИАСУ, разрабатываемый фирмой Biotope Inc. под торговой маркой BioMAT-EIA™, представлен на рис. 6.5. Основой этого метода являются несмешивающиеся растворы реагентов, расположенные слоями и обеспечивающие последовательное проведение реакций и отделение связанных реагентов от несвязанных in situ. Описана также модификация BioMAT™ с использованием радиоиммуноанализа.
В типичном гетерогенном анализе самый верхний слой содержит связанные с антителами гранулы, предварительно смешанные с ферментным конъюгатом. Гранулы диаметром несколько микрометров позволяют значительно ускорить реакцию антиген – антитело по сравнению с трубками или гранулами больших размеров. Реакцию начинают, вводя пробу в анализатор через самоуплотняющуюся мембрану. После инкубации для обеспечения специфического связывания анализатор недолго центрифугируют, заставляя гранулы пройти через не смешивающийся с водой слой. На этой стадии от гранул отделяется несвязавшийся конъюгат. Далее гранулы попадают в нижний слой, содержащий проявляющий для данной ферментной метки раствор. Появление цвета наблюдается только в нижней части пробирки. Интенсивность окраски можно оценить визуально или с помощью специального колориметра. Стадия центрифугирования занимает не более 1 мин, а все необходимые для анализа реагенты находятся уже в пробирке. В анализатор добавляют только изучаемую пробу. В принципе возможен и внутренний контроль, если в анализатор ввести гранулы, с которыми связано определяемое вещество, причем плотность этих гранул должна отличаться от плотности гранул с антителами. Тогда после центрифугирования на другой высоте появится еще одна окрашенная полоса.
Если центрифугирование по каким-либо причинам нежелательно, то для разделения можно использовать намагниченные гранулы и магнитное поле. Метод BioMAT можно адаптировать и для других, более чувствительных, систем обнаружения, например путем измерения флуоресценции с временным разрешением. В методе BioMAT-FIA™ антитела могут содержать лантанидные метки, которые после связывания с определенными хелатирующими агентами флуоресцируют необычно долгое время. Таким образом, можно подавить влияние собственной флуоресценции пробы. Однако максимальную интенсивность флуоресценции лантанидные комплексы проявляют в неводном окружении, поэтому в обычных методах вводят дополнительную стадию перевода пробы в неводную среду. Эта операция в BioMAT-FIA™ исключается за счет использования экстракционных материалов в гидрофобном слое анализатора.
Похожие работы
... . Перед винированием в течение месяца проводится реминерализующая терапия, эмаль при этом не протравливается. АТТЕСТАЦИОННЫЙ МАТЕРИАЛС АНАЛИЗОМ РАБОТЫ ЗА ТРИ ГОДА 1997-1999 гг. ВРАЧА-СТОМАТОЛОГА МУ “ДЕТСКАЯ СТОМАТОЛОГИЧЕСКАЯ ПОЛИКЛИНИКА” ТОКУЕВОЙ Т.И.г. АРХАНГЕЛЬСК 2000 г. Периодонтиты. При диагностике пользуюсь классификацией профессора Виноградовой Т.Ф., основанной на клиническом течение ...
Анализ противотуберкулезных мероприятий, проводимых медицинской сестрой в санаторной школе-интернате
... усиления профилактической работы со стороны всего медицинского персонала, независимо от места работы. Раздел 3. Результаты собственных исследований 3.1 Анализ противотуберкулезных мероприятий проводимых медицинской сестрой в школе-интернате Общая характеристика учащихся школы Возрастной состав учащихся от 7 до 16 лет. Таблица№1 Количество учащихся в школе-интернате по половому ...
... источников инвестирования. В связи с вышеизложенным, тема работы – анализ финансового состояния, является актуальной. Целью работы является проведение анализа финансового состояния одного из ведущих санаторно-курортных учреждений Пятигорского курорта по результатам его деятельности в 2001 году. Для достижения этой цели предполагается решить ряд взаимосвязанных задач: 1.Изучить динамику ...
... обслуживания семейного врача; характера ассигнований по оплате расходов службы семейного врача, источника их финансирования, их объема и стабильности. Однако несомненно одно — чем лучше будет оснащено рабочее место семейного врача, тем оптимальнее будут условия его работы. Комплекты лечебных препаратов и инструментов для оказания семейным врачом помощи на дому. Довольно-таки часто в практике ...
0 комментариев