5. Дослідити дозозалежну гіпогомоцистеїнемічну дію ВМК в умовах гіповітамінозно-метіонінової ГГЦ.
6. Дослідити зміни мікроскопічної будови внутрішніх органів щурів (серце, легені, нирки, печінка, шлунок, кишківник, сім’яники, сітківка ока та головний мозок) за гіповітамінозно-метіонінової ГГЦ та здатність ВМК в цих умовах відновлювати порушену структуру органів.
Об’єкт дослідження: гіпергомоцистеїнемія.
Предмет дослідження: лікувально-профілактична дія нового вітамінно-мікроелементного комплексу на моделях гіпергомоцистеїнемії.
Методи дослідження: фармакологічні, біохімічні, гематологічні, мікробіологічні, морфологічні та статистичні.
Наукова новизна дослідження. Достеменно підтверджено, що гіповітамінозно-метіонінова ГГЦ супроводжується пошкодженням судинного русла внутрішніх органів, у т.ч. серця, легень, нирок та печінки. Досліджено основні сторони фармакологічної дії ВМК та встановлено переваги його активності на досліджених моделях гіпергомоцистеїнемії у щурів: нормалізації відхилень, індукованих ГГЦ у порівнянні з певною комбінацією вітамінів В6, В9, В12 [R.Clark, 1998] та препаратом “Декамевіт”. Вперше показано, що композиція мікроелементів на основі координаційних сполук цинку та хрому з N-2,3-диметилфенілантраніловою кислотою та ванадатом амонію підсилює специфічну гіпогомоцистеїнемічну дію вітамінів В6, В9 та В12. Вперше запропонована класифікація гіпогомоцистеїнемічних лікарських засобів, заснована на аналізі механізму їх дії.
Практичне значення одержаних результатів. Проведені експериментальні дослідження показали доцільність застосування ВМК, що містить вітаміни В6, В9, В12 та мікроелементи Zn, Cr, V, з профілактично-лікувальною метою при ГГЦ. На основі літературних та власних даних у співавторстві розроблені методичні рекомендації “Доклінічні дослідження гіпогомоцистеїнемічної дії потенційних лікарських засобів”.
Впровадження результатів дослідження в практику. За результатами дослідження отримано 1 патент України на винахід. Основні положення дисертації використовуються в навчальному процесі на кафедрах Вінницького національного медичного університету ім. М.І.Пирогова (кафедри фармакології, патологічної анатомії), Тернопільського державного медичного університету ім. І.Я.Горбачевського (кафедра медичної хімії), Буковинського державного медичного університету (кафедри фармації та медичної хімії), Ужгородського національного університету (кафедра біохімії і фармакології).
Особистий внесок здобувача. Автором особисто проведено патентно-інформаційний пошук, аналіз даних літератури за темою дисертації, опрацьовано моделі, згідно з якими особисто виконано експериментальні дослідження. Дисертант самостійно провів статистичну обробку та аналіз первинного матеріалу, написав всі розділи дисертації, сформулював висновки та практичні рекомендації. Мікробіологічні дослідження проведені на кафедрі мікробіології, вірусології та імунології ВНМУ ім. М.І. Пирогова (зав. каф. – проф. Г.К. Палій), гістологічні – на кафедрі гістології та ембріології ВНМУ ім. М.І. Пирогова (зав. каф. – проф. М.С. Пушкар), гістохімічні у відділі морфології ІФТ АМН України (зав. відділом – ст.н.с. О.В. Сергієнко), за що дисертант їм щиро вдячний.
Апробація результатів дослідження. Результати роботи були оприлюднені на науково-практичних конференціях “Біопсихосоціальні аспекти здоров’я: здоров’я здорових” (Вінниця, 2004), "Сучасний стан і проблеми експериментальної та клінічної медицини" (Тернопіль, 2004), “Новітні технології у медицині” (Вінниця, 2005), на ІХ з'їзді Всеукраїнського Лікарського Товариства (Вінниця, 2007).
Публікації. За матеріалами досліджень опубліковано 10 наукових праць: 5 статей у виданнях, рекомендованих ВАК України, 4 тез в матеріалах наукових конференцій і з’їздів, 1 методичні рекомендації.
Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на 174 сторінках машинопису та містить 30 таблиць, 32 рисунки (з них 27 мікрофотографій). Дисертація складається із вступу, огляду літератури, розділу «Матеріали і методи дослідження, моделювання гіпергомоцистеїнемії», 3-х розділів власних досліджень, аналізу та узагальнення результатів дослідження, висновків, практичних рекомендацій та списку використаних джерел, який включає 270 джерелo, у тому числі 211 зарубіжних авторів.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Матеріали та методи дослідження. Предметом експериментального дослідження був новий вітамінно-мікроелементний комплекс, розроблений сумісно співробітниками Інституту фармакології та токсикології АМН України та ВНМУ ім. М.І. Пирогова, який містить суміш координаційних сполук цинку, хрому з N-2,3-диметилфенілантраніловою кислотою (HL), ванадат амонію та специфічні для лікування гіпергомоцистеїнемії вітаміни: В6 – піридоксин, В9 – фолієва кислота , В12 – ціанокобаламін. Один грам суміші містить: ZnL2·2H2O – 127 мг (Zn2+ – 14 мг), CrL3·2H2O – 1,64 мг (Cr3+ – 105 мкг), (NH4)3 VO3 – 38 мкг (V 5+ – 13 мкг), В6 – 10 мг, В9 – 2 мг, В12 – 0,2 мг та допоміжні речовини.
Вибір цих мікроелементів зумовлений тим, що ферменти метилювання гомоцистеїну (метіонінсинтетаза та бетаїнгомоцистеїнтрансфераза) є Zn-залежними металоензимами [C.W.Goulding et al., 1997; N.S.Millian et al., 1998; J.L.Ferrer et al., 2004; S.Ratnam et al., 2006], а більшість мікроелементів, у тому числі ванадій та хром, є незалежними чинниками нормального функціонування серцево-судинної системи [А.В.Кудрин, О.А.Громова, 2006]. Вважають, що вітамінно-мінеральні комплекси виявляють високу біологічну та лікувальну активність, при включені до них легкозасвоюваних форм мінеральних солей [Г.С. Григор’єва та співавт., 2004]. В зв’язку з цим, до складу ВМК включені сполуки цих мікроелементів. Для порівняння використані два препарати, близькі до ВМК по вітамінному складу. Першим препаратом порівняння (ПП-1) слугувала композиція, описана в роботі R.Clark (1998), яка в клінічних умовах у порівнянні з 19 іншими комбінаціями вітамінів В6, В9, В12 виявляє найвищий гіпогомоцистеїнемічний ефект. Ця композиція включає високі добові дози вітамінів В6, В9, В12 – 10,0; 1,0; 0,4 мг, відповідно, і забезпечує зниження рівня ГЦ в крові пацієнтів з ГГЦ майже на 60%. В якості іншого препарату порівняння (ПП-2) використано відомий в Україні полівітамінний комплекс “Декамевіт” – єдиний з полівітамінних препаратів, що містить в одній таблетці високі дози вітамінів В6, В9, В12 – 20,0; 2,0; 0,1 мг, відповідно.
ВМК та препарати порівняння в тривалих дослідах (10-20 діб) вводили тваринам з дієтою, в короткочасних дослідах – за допомогою зонду в шлунок. Добове дозування ВМК та препаратів порівняння: тваринам на 1 кг маси тіла вводили дози, що в 5 разів перевищують передбачені для людини. Так, у випадку ВМК щури в якості добової дози вітамінів В6, В9, В12 отримували 715; 143; 14,3 мкг/кг маси тіла, та мікроелементів: Zn2+ – 1 мг/кг, Cr3+ – 7,5 мкг/кг, V5+ – 0,93 мкг/кг, в той час як для людини пропонована добова доза цих компонентів в складі ВМК – 143; 28,6; 2,86 мкг/кг та 0,2 мг/кг; 1,5 мкг/кг; 0,186 мкг/кг, відповідно.
Тварини та дієти. Експериментальні дослідження проведені на 377 статевозрілих білих щурах-самцях з масою тіла 200±30 г. Тварин утримували на напівсинтетичній крохмально-казеїновій дієті з контрольованим вмістом всіх нутрієнтів, яку модифікували в залежності від мети експерименту.
Моделі ГГЦ. Використані три моделі гіпергомоцистеїнемії – гостра метіонінова, хронічна метіонінова та комбінована гіповітамінозно-метіонінова (ГМГ). Вказані моделі дозволяли підвищити рівень ГЦ в плазмі крові експериментальних тварин: за гострої ГГЦ ~ в 5 разів, за хронічної ГГЦ – в 1,5-2 рази, за ГМГ – в 11-13 разів.
Біохімічні, мікробіологічні та гематологічні дослідження. Досліджували кров, плазму або сироватку крові, гомогенати печінки та нирок. Вміст ГЦ в плазмі крові визначали на апараті Hewlett Packard (США) з використанням колонки Hypersil BDS C-18 методом високоефективної рідинної хроматографії в модифікації [О.О. Пентюк та співавт., 2001]. Рівень білка визначали уніфікованим біуретовим методом [В.В. Меньшиков, 1987], середні молекули (СМ), як показник ендотоксикозу, методом [Н.И. Габриэлян, В.И. Липатова, 1984], малоновий діальдегід (МДА) – за допомогою тіобарбітурової кислоти [В.Н. Орехович, 1977], гідроперекиси (ГП) методом [В.Б. Гаврилов, М.И. Мишкорудная, 1983], карбонільні групи (КГ) білків реакцією з фенілгідразином [H. Refsgaard, 2000]. Визначали забезпеченість тварин, що перебували на гіповітамінозно-метіоніновій дієті, вітамінами – фолієвою кислотою (прямим методом) та вітамінами В6 і В12 (непрямими методами). Вміст фолату в плазмі крові визначали мікробіологічним методом за допомогою фолатдефіцитного штаму Lactobacillus casei АТСС 7469 [Ю.М. Островский, 1979], статус вітаміну В6 – по активності в печінці ферментів АСТ та АЛТ [В.В. Меньшиков, 1987], вітаміну В12 – по екскреції з сечею метилмалонової кислоти [Л.В.Снегирева, 1972]. Вміст гемоглобіну визначали за допомогою геміглобінціанідного методу, кількість еритроцитів та лейкоцитів – в камері Горяєва. Ці дослідження виконані в акредитованій для біохімічних досліджень науково-дослідній клініко-діагностичній лабораторії ВНМУ ім.М.І.Пирогова (завідувач лабораторією професор О.О. Пентюк).
Морфологічні дослідження. Протягом експерименту визначали мікроскопічну будову внутрішніх органів шляхом зафарблення зрізів тканин гематоксиліном та еозином і гістохімічними методами [Н.З. Слінченко, 1964], Picro-Mallory V [Д.Д.Зербино, Л.Л. Лукасевич, 1989] для виявлення наявності в судинах фібрину та його “віку”.
Статистичні методи. Отримані цифрові дані підлягали обробці за допомогою методів варіаційного аналізу з використанням пакету прикладних програм Statistica 6.0 for Windows 98. Підраховували середні значення критеріїв, а також середньоквадратичні відхилення (М±m). Використовували також універсальні статистичні пакети до персонального комп’ютера “Exсel”. Для визначення зв’язків між показниками використовували кореляційний аналіз (з вираховуванням r) по Пірсону [Е.В.Гублер, 1978]. Достовірною вважалась різниця за Р≤0,05.
Результати досліджень та їх обговорення. Виявлено, що протягом експериментів, проведених на трьох моделях ГГЦ, у тому числі на гіповітамінозно-метіоніновій, використані дієти забезпечують нормальний приріст маси тіла тварин всіх груп, крім того щури візуально мають звичайний вигляд та поведінку. Відсутність негативного впливу на масу тварин гіповітамінозно-метіонінової дієти пояснюється тим, що в дослід були взяті дорослі, а не молоді тварини та відносно невеликою (14 діб) тривалістю дослідів. Характерно, що ВМК та препарати порівняння не справляли помітної негативної дії на загальний стан тварин, а також не виявили здатності гальмувати чи стимулювати їх ріст.
0 комментариев