3.2. Морфологічні дослідження (патанатомічні, гістологічні, гістохімічні)
При зовнішньому огляді, патологоанатомічному розтині, визначенні абсолютної та відносної маси органів щурів з ГМГ ніяких змін відносно контролю не було виявлено.
Проведено гістологічне та гістохімічне дослідження органів тварин – серця, легенів, печінки, нирок, шлунку та кишківнику, сім’яників, передміхурової залози, сітківки ока та головного мозку. Більш детально вивчена мікроскопічна структура серця, легенів, нирок та печінки. Вибір саме цих органів зумовлений їх активною участю в функціонуванні серцево-судинної системи та (для печінки і нирок) – в обміні ГЦ. Дослідження тварин з ГМГ виявило наявність суттєвих ушкоджень судинного русла, ознак гемоциркуляторних розладів та альтеративних змін паренхіми окремих органів, вірогідно гіпоксичного та метаболічного генезу.
В міокарді тварин з ГМГ просвіт інтрамуральних судин розширений, заповнений кров’ю, в частині артерій середнього та малого калібру і вен відмічаються ознаки ушкодження стінки у вигляді набряку ендотеліоцитів та плазматичного просочення медії, стази та тромбози, які, за даними гістохімічного дослідження, відповідають давнині утворення 18-24 години та більше. В окремих місцях кардіоміоцити мають ознаки вогнищевих, переважно зворотних, сегментарних та субсегментарних контрактурних змін I – III ступеня (рис.2).
У тварин, яких лікували ВМК та ПП-1, вже через 10 діб відмічались позитивні зрушення структури міокарду, головне – не знайдені артеріальні та венозні тромбози. Разом з тим залишкові зміни були більш вираженими за лікування ПП-1. 20-ти добове лікування в обох випадках практично повністю нормалізувало структуру міокарду. При 10-добовому лікуванні тварин з ГМГ за допомогою ОД гістопатологічні зміни не зменшились, навіть відбулось їх наростання, а через 20 діб у таких тварин в міокарді спостерігались вже незворотні зміни (рис 3). Ці дані свідчать про те, що повноцінна дієта (ОД) є недостатнім фактором для лікування синдрому ГГЦ.
В легенях тварин з експериментальною ГМГ на 15 добу спостереження відмічаються судинні порушення без ознак ушкодження паренхіми. В міжальвеолярних перетинках судини повнокровні, в частині артеріальних та венозних судин відмічаються стази і тромбози. Стінка окремих артерій потовщена, клітини м’язевої оболонки її набряклі, ендотеліоцити місцями розташовані частоколом, частина з них збільшена в розмірах, набрякла. Певні гістологічні зрушення за ГМГ відбуваються також в структурі бронхіального дерева, міжальвеолярних перетинках, нервових та лімфатичних утвореннях легень (рис.4).
Лікування ВМК та ПП-1 протягом 10 діб виявилось досить ефективним: за введення ВМК структура легень практично не відрізнялась від норми, а після лікування ПП-1 мікроскопічна картина лише незначно відрізнялася від контролю. Лікування тварин ОД було менш ефективним: тільки через 20 діб мікроскопічна структура легенів щурів набула нормального вигляду.
В нирках за ГМГ відмічені такі зміни. Клубочки приблизно однакових розмірів, повнокровні, базальна мембрана їх капілярів тонка, в отворах мікросудин знаходиться значна кількість еритроцитів. Стінка окремих артерій набрякла, потовщена, отвір артеріальних судин розширений, переповнений кров’ю, в деяких артеріальних та венозних судинах виявлено тромби, “вік” яких становить 18-24 години та більше. Епітеліальні клітини проксимальних звивистих канальців мають ознаки розповсюджених виражених дистрофічних змін, відмічаються окремі вогнища некрозу (рис. 5). Вказані відхилення, індуковані в нирках за ГМГ, близькі до тих що описані в
Через 10 діб лікування ВМК мікроскопічна будова нирок практично не відрізнялась від контролю, а у тварин, що лікувалися препаратом ПП-1 – майже нормалізувалася: спостерігались незначний мезангіальний набряк та залишкові дегенеративні процеси у канальцевому епітелії. Через 20 діб лікування тварин з ГМГ введенням ВМК та ПП-1 будова нирок не відрізнялася від контролю. При застосування ОД явні патологічні зміни в нирках відмічалися навіть через 20 діб лікування.
В печінці щурів, крім ознак ушкодження стінки поодиноких судин з периваскулярною вогнищевою лейкоцитарною інфільтрацією, відмічались виражена розповсюджена альтерація гепатоцитів, що мала характер як стеатозу та дистрофічних змін, так і окремих вогнищ переважно моноцелюлярного некрозу. Місцями спостерігалось венозне повнокрів’я печінки, фіброз та склероз міжчасточкових перегородок. Поряд з жировою дистрофією в окремих гепатоцитах відмічались ознаки гіаліновокраплинної дистрофії у вигляді брилуватих та сітчастих еозинофільних включень у цитоплазмі.
Лікування тварин з ГМГ введенням ВМК та ПП-1 виявилось доволі ефективним: вже через 10 діб під дією ВМК структура печінки практично не відрізнялася від такої у тварин з груп інтактного контролю, в той час як після лікування ПП-1 збереглися незначні відхилення. Позитивний лікувальний вплив ВМК був виявлений при дослідженні і інших органів.
ВИСНОВКИ
В дисертаційній роботі експериментально обгрунтовується доцільність застосування нового вітамінно-мікроелементного комплексу для профілактики та лікування гіпергомоцистеїнемії.
1. У білих нелінійних щурів з гострою та хронічною моделлю ГГЦ, викликаною введенням L-метіоніну, так само, як і з гіповітамінозно-метіоніновою моделлю, реєструється значне підвищення рівню гомоцистеїну (в 4,5-5,1; 2,2; 11-13 разів, відповідно) в плазмі крові, виникають явища оксидативного стресу – вміст малонового діальдегіду в крові, печінці та нирках підвищується на 65,8; 57,0; 20%, відповідно, кетогруп білків на 57,6; 84,8; 46,7%, відповідно, гідропероксидів в печінці на 37,8%, в нирках – на 40,8%. За гіповітамінозно-метіонінової ГГЦ формується ендотоксикоз – рівень молекул середньої маси в крові підвищується на 53,6%.
2. На моделі гострої ГГЦ, викликаної L-метіоніном, 10-добове внутрішньошлункове введення щурам ВМК значно зменшувало рівень гомоцистеїну в плазмі крові (2,86±0,26 мкг/мл, в контролі ГГЦ – 8,26±1,53 мкг/мл). За цим показником ВМК вірогідно переважав препарат порівняння ПП-2 (3,86±0,32 мкг/мл) та дорівнював ПП-1.
3. Лікувально-профілактичне введення білим щурам з моделлю хронічної метіонінової ГГЦ вітамінно-мікроелементного комплексу протягом 15 діб практично нормалізувало рівень гомоцистеїну (знизився з 3,70±0,30 мкг/мл до 1,87±0,23 мкг/мл), а також зменшувало вміст малонового діальдегіду в сироватці крові (з 17,80±0,95 до 13,20±0,88 мкмоль/л) і кетогруп білків (з 60,3±2,5 до 42,8±2,0 мкг/100мг білка). За двома останніми ефектами ВМК вірогідно переважав ПП-1 (15,90±0,74 мкмоль/л та 55,3±2,6 мкг/100мг білка, відповідно) і дорівнював ПП-2.
4. В умовах сформованої хронічної метіонінової ГГЦ щодобове внутрішньошлункове введення ВМК протягом 3 діб нормалізувало вміст гомоцистеїну в плазмі крові білих щурів (1,44±0,19 мкг/мл), малонового діальдегіду (14,20±0,83 мкмоль/л) та кетогруп білків (50,5±2,5 мкг/100 мг білка) в сироватці крові. Дія ВМК була тотожною такій ПП-2 та переважала ефект ПП-1 (за рівнем малонового діальдегіду та кетогруп білків).
5. На моделі гіповітамінозно-метіонінової ГГЦ щодобове введення ВМК протягом 4 діб нормалізувало вміст гомоцистеїну в плазмі крові білих щурів (рівень знизився з 19,20±2,60 до 0,86±0,12 ), а після дії ПП-1 – до 1,58±0,21 (при 1,43±0,26 мкг/мл у інтактних тварин). Препарат порівняння ПП-2 нормалізував цей показник лише на 10 добу.
6. Застосування ВМК у білих щурів з гіповітамінозно-метіоніновою ГГЦ на 4 добу нормалізувало вміст молекул середньої маси (рівень зменшився з 0,424±0,016 до 0,276±0,020 од), а на 10 добу – рівень малонового діальдегіду, кетогруп білків, гідроперекисів в сироватці крові, печінці та нирках. За цими показниками ВМК дорівнював ПП-2 та вірогідно перевищував ПП-1.
7. У білих щурів з гіповітамінозно-метіоніновою ГГЦ реєструються морфологічні ознаки ушкодження судинного русла (повнокрів’я, набухання стінки судин, десквамація ендотелію, тромбоз окремих судин різної давнини та інші), паренхіми печінки та нирок гіпоксичного та метаболічного характеру (дистрофія, стеатоз, гломерулосклероз та інші). Лікування ВМК при цій патології відновлює структуру судин та органів на 10 добу, а при використанні ПП-1 на 20 добу.
8. Механізм лікувально-профілактичної дії ВМК, ймовірно, обумовлений в першу чергу зниженням в плазмі крові ГЦ за рахунок прискорення його метаболізму під впливом вітамінів та мікроелементів.
ПРАКТИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ
1. За механізмом дії сучасні засоби лікування ГГЦ доцільно поділити на 4 групи: а) прямої гіпогомоцистеїнемічної дії (активують обмін ГЦ чи сприяють екскреції його з сечею); б) з опосередкованою гіпогомоцистеїнемічною активністю (знижують потребу в S-аденозилметіоніні або мають нез’ясований механізм впливу); в) засоби, дія яких спрямована на корекцію ускладнень, викликаних ГГЦ; г) комбіновані препарати, що в одній лікарській формі містять речовини з різним механізмом дії.
2. При станах, що супроводжуються підвищеним вмістом гомоцистеїну в плазмі крові, з лікувальною метою слід застосовувати новий вітамінно-мікроелементний комплекс (вітаміни В6, В9, В12, цинк, хром, ванадій).
СПИСОК ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ
1. Пентюк О.О., Луцюк М.Б., Постовітенко К.П., Артемчук М.А., Асачова О.С., Призимирська Т.В. Гіпергомоцистеїнемія: моделювання та вплив на стан судинної системи в експерименті // Досягнення біології та медицини. - 2004. – Т.3, №1. - С.35-38. (Здобувач провів експериментальні дослідження на моделі хронічної ГГЦ, статистичну обробку отриманих результатів, написав висновки).
2. Постовітенко К.П., Пентюк О.О., Луцюк М.Б., Призимирська Т.В., Артемчук М.А., Андрушко І.І., Чехун В.Ф., Чорнопищук О.Л. Біохімічні зміни в крові, печінці та нирках при експериментальній гіпергомоцистеїнемії за її лікування вітамінами та вітамінно-мінеральним комплексом // Вісник Вінницького національного медичного університету. - 2005. - Т.9, №2. - С.222-227. (Здобувач провів випробовування ВМК на моделі гіповітамінозно-метіонінової ГГЦ та узагальнив результати).
3. Постовітенко К.П., Пентюк О.О., Луцюк М.Б., Сергієнко О.В., Артемчук М.А., Андрушко І.І., Харковенко Р.В., Чехун В.Ф., Призимирська Т.В. Морфологічні зміни в органах тварин з експериментальною гіпергомоцистеїнемією та можливість їх корекції дієтами, збагаченими вітамінами // Вісник морфології. - 2005. - Т.11, №2. - С.287-291. (Здобувач провів морфологічні дослідження та визначив статус вітамінів В6, В9, В12).
4. Артемчук М.А. Профілактично-лікувальна дія вітамінних та вітамінно-мікроелементних препаратів за гострої і хронічної метіонінової гіпергомоцистеїнемії // Biomedical and Biosocial Anthropology. - 2006. - Т.7. - С. 17-20.
5. Артемчук М.А. Синдром гіпергомоцистеїнемії – принципи лікування та підходи до класифікації гіпогомоцистеїнемічних лікарських препаратів, засновані на аналізі механізму їх дії // Biomedical and Biosocial Anthropology. - 2007. - Т.9. - С. 47-51.
6. Постовітенко К.П., Істошин В.М., Тертишна О.В., Артемчук М.А., Харковенко Р.В., Луцюк М.Б. Гіпергомоцистеїнемія як фактор ураження судин / Біопсихосоціальні аспекти здоров'я: здоров'я здорових: Матеріали наук.-практ. конференції. Вінниця, 21-22 жовт. 2004 р. - Вінниця, 2004. - С.94-95.
7. Харковенко Р.В., Артемчук М.А., Постовітенко К.П., Луцюк М.Б., Салдан Й.Р., Сергієнко О.В. Вплив вітамінно-мікроелементного препарату на рівень гомоцистеїну в плазмі крові та патоморфологічні зміни в оці, викликані експериментальною гіпергомоцистеїнемією / Сучасний стан і проблеми експериментальної та клінічної медицини: Міжнар. наук.-практ. конференція. Тернопіль, 11-12 листоп. 2004р. // Медична хімія. - 2004. - Т. 6, №3.- С. 175.
8. Артемчук М.А. Вплив різних доз вітамінів В6, В9, В12 та вітамінно-мікроелементного комплексу на швидкість нормалізації біохімічних та морфологічних порушень, що виникають за гіпергомоцистеїнемії / Новітні технології у медицині: Міжнар. наук.-практ. конференція. Вінниця, 14-15 трав. 2005р. – Вінниця, 2005. - С.50-51.
9. Артемчук М.А., Пентюк О.О., Луцюк М.Б., Постовітенко К.П., Йолтуховський М.М., Постовітенко О.П., Андрушко І.І., Мельник А.В. Підходи до класифікації фармзасобів з гіпогомоцистеїнемічною активністю по механізмам їх дії / Тези доповідей ІХ з'їзду Всеукраїнського Лікарського Товариства. Вінниця, 10-12 травня 2007р. // Українські Медичні Вісті. - 2007. – Т.7. - С.250.
10. Патент України №66134 А; Експериментальна модель гіпергомоцистеїнемії. В.Ф.Чехун, М.Б. Луцюк, О.О.Пентюк, Т.В.Призимирська, К.П.Постовітенко, М.А.Артемчук, Й.Р.Салдан, О.С.Асачова. - Опубл. 15.04.2004. - Бюл №4. – 6 с.
11. Доклінічні дослідження гіпогомоцистеїнемічної дії потенційних лікарських засобів. О.О.Пентюк, М.Б.Луцюк, М.А.Артемчук та ін. –К.: ДФЦ МОЗ України, 2007. - 30 с.
АНОТАЦІЯ
Артемчук М.А. Гіпогомоцистеїнемічна дія нового вітамінно-мікроелементного комплексу (експериментальне дослідження). – Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 14.03.05 – фармакологія. – Державна установа "Інститут фармакології та токсикології" АМН України, Київ, 2008.
На білих нелінійних щурах-самцях (n=377), які утримувались на стандартній напівсинтетичній крохмально-казеїновій дієті, проведені експериментальні дослідження специфічної (гіпогомоцистеїнемічної) активності нового вітамінно-мікроелементного комплексу (ВМК), до складу якого входять вітаміни В6, В9, В12, а також мікроелементи цинк, хром та ванадій. Дослідження проведено у порівнянні з специфічною дією двох інших комплексів – препаратом порівняння 1 (ПП-1, склад згідно R.Clark, 1998), та препаратом порівняння 2 (ПП-2, полівітамінний препарат «Декамевіт»). На трьох експериментальних моделях гіпергомоцистеїнемії (гостра метіонінова, хронічна метіонінова та комбінована гіповітамінозно-метіонінова) з використанням біохімічних, гематологічних, морфологічних та гістохімічних методів дослідження показано, що ВМК та препарати порівняння володіють гіпогомоцистеїнемічною активністю та здатністю нормалізувати порушення, індуковані гіпергомоцистеїнемією, але профілактична та лікувальна дія ВМК виявилась у більшості випадків вищою у порівнянні з ПП-1 та ПП-2. Зроблено висновок, що досліджуваний вітамінно-мікроелементний комплекс є конкурентноздатним у порівнянні з сучасними аналогами (ПП-1 та ПП-2) і може бути рекомендований для доклінічних та клінічних випробувань.
Ключові слова: гіпергомоцистеїнемія, моделі гіпергомоцистеїнемії, препарати гіпогомоцистеїнемічної дії.
АННОТАЦИЯ
Артемчук М.А. Гипогомоцистеинемическое действие нового витаминно-микроэлементного комплекса (экспериментальное исследование). – Рукопись.
Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по специальности 14.03.05 – фармакология. – Государственное учреждение "Институт фармакологии и токсикологии" АМН Украины, Киев, 2008.
Синдром гипергомоцистеинемии – повышенное содержание в плазме крови аминокислоты гомоцистеина – в последние годы привлекает внимание медиков из-за его тесной связи с сердечно-сосудистой патологией и многими другими заболеваниями и состояниями (сахарный диабет, псориаз, почечная недостаточность, шизофрения, депрессии, болезнь Альцгеймера, дефекты развития в онтогенезе, рак прямой кишки и др.). Негативное влияние гипергомоцистеинемии на организм реализуется путем угнетения процессов метилирования, химической модификации белков, стимуляции оксидативного стресса и тромбогенеза, влияния на экспрессию генов и другие процессы. Подтверждением значительной роли гипергомоцистеинемии в прогрессировании сердечно-сосудистой патологии является тот факт, что назначение гипогомоцистеинемической терапии приводит не только к снижению уровня гомоцистеина в плазме крови, но и к позитивной динамике отклонений со стороны сердечно-сосудистой системы и улучшению функции эндотелия. Имеются данные о том, что снижение концентрации гомоцистеина в плазме крови на 3 ммоль/л снижает частоту ишемической болезни сердца на 16 %, тромбозов на 25 %, сердечных приступов – на 24 %. В связи с этим, поиск средств гипогомоцистеинемического действия является актуальной фармакологической проблемой.
Диссертация посвящена экспериментальным исследованиям гипогомоцистеинемической активности нового витаминно-микроэлементного комплекса (ВМК), созданного в Институте фармакологии и токсикологии АМН Украины совместно с Винницким национальным медицинским университетом им. Н.И. Пирогова. ВМК имеет в своем составе высокие дозы витаминов В6, В9 и В12, коферментные формы которых принимают непосредственное участие в метаболизме гомоцистеина, а также микроэлементы цинк, хром и ванадий усиливающие специфическую активность ВМК. Способность витаминно-микроэлементного комплекса снижать уровень гомоцистеина, а также предотвращать и лечить нарушения, индуцируемые гипергомоцистеинемией, сравнивалась с действием двух других препаратов, близких к ВМК по витаминному составу - препаратом сравнения 1 (ПС-1, по R.Clark, 1998) и препаратом сравнения 2 (ПС-2, поливитаминный препарат «Декамевит»).
Эксперименты проведены на взрослых белых крысах-самцах (n=377), которые содержались на стандартной крахмально-казеиновой диете. Использованы 3 модели гипергомоцистеинемии: острая метиониновая, хроническая метиониновая и гиповитаминозно-метиониновая, которые обеспечивали повышение уровня гомоцистеина в плазме крови животных приблизительно в 5, 2 и 13 раз, соответственно. Для кормления животных применялись диеты, обогащенные L-метионином – аминокислотой, которая является единственным источником гомоцистеина в организме, а также другими компонентами в зависимости от условий эксперимента.
В работе использованы такие методы исследования: биохимические (определение концентраций белка, гомоцистеина, средних молекул, малонового диальдегида, гидроперекисей, кетогрупп белков, активности ферментов АЛТ, АСТ, СОД), микробиологические (определение фолата), гематологические (определение количества эритроцитов, лейкоцитов, уровня гемоглобина), микроскопические (исследования всех основных внутренних органов, гистохимическое выявление тромбов и определение их возраста по методу Слинченко), статистические.
Показано, что на моделях острой и хронической гипергомоцистеинемии ВМК, как и препараты сравнения, могут частично предупреждать гипергомоцистеинемическую активность метионина, но эффективность ВМК при этом оказалась более высокой. На модели хронической метиониновой гипергомоцистеинемии все исследуемые комплексы обнаружили приблизительно одинаковую лечебно-профилактическую активность, однако способность нормализовать процессы пероксидации липидов и белков, оказалась одинаковой у ВМК и ПС-2, но более высокой, чем у ПС-1.
На модели гиповитаминозно-метиониновой ГГЦ ежесуточное введение ВМК в течение 4 суток нормализовало содержание гомоцистеина в плазме крови белых крыс, аналогично ПС-1. Препарат сравнения-2 нормализовал этот показатель только на 10 сутки. Антиоксидантное действие ВМК было равным ПC-2 и превосходило ПC-1. Способность ВМК к репарации морфологических изменений, вызванных гипергомоцистеинемией, была более высокой, чем у ПС-1.
Результаты исследований свидетельствуют о том, что новый витаминно-микроэлементный комплекс ВМК имеет высокую специфическую гипогомоцистеинемическую активность и способен ускорять нормализацию изменений, индуцированных гипергомоцистеинемией. Эти данные, на наш взгляд, свидетельствуют о целесообразности дальнейшего углубленного изучения ВМК на предмет создания на его основе нового средства, пригодного для профилактики и лечения гипергомоцистеинемии, конкурентоспособного с современными аналогами (ПС-1 и ПС-2). Кроме того, в результате анализа литературных данных и с учетом собственных исследований автором диссертации предложена современная классификация лекарственных средств с гипогомоцистеинемической активностью, основанная на механизме их действия.
Ключевые слова: гипергомоцистеинемия, модели гипергомоцистеинемии, препараты гипогомоцистеинемического действия
SUMMARY
Artemchuk M.A. Hypohomocystinemic action of new vitamin-microelement complex (experimental studies). – Manuscript.
Dissertation for a degree of candidate of medical science in speciality 14.03.05 of pharmacology. – State organization "The Institute of Pharmacology and Toxicology" AMS of Ukraine, Kyiv, 2008.
We made preclinical investigation on white nonlinear male rats, which were on standart semisenthetic starch-casein diet, of specific activity of new vitamin-microelement complex (VMC), which consists of vitamins В6, В9, В12, also microelements such as zinc, chrome and vanadium. Researchers have been done in comparison with specific action of 2 (two) other complexes, close to VMC in vitamin composition, preparation of composition 1 (PP-1, composition according to R.Clark, 1998), and preparation of comparison 2 (PP-2, polyvitamin preparation “Decamevit”). It was shown on 3 (three) experimental models of hyperhomocysteinemia (strong methionine, chronic methionine and combined hypovitamin-methionine) using biochemical, hematological, morphological and hystochemical methods of research are shown, that both VMC and preparations of comparison possess hypohomocysteinemic activity and ability to normalize disorders induced by hyperhomocysteinemia, but prophylactic and therapeutic effect of VMC appeared to be higher in most of cases comparing to PP-1 and PP-2. We made the conclusion that researched vitamin-microelement complex is rivalries in comparison with modern analogs (PP-1 and PP-2) and can be recommended for preclinical and clinical investigations.
Key words: hyperhomocysteinemia, models of hyperhomocysteinemia, preparations of hypohomocysteinemic action.
Перелік умовних позначень, скорочень і термінів
АЛТ – аланінамінотрансфераза
АСТ – аспартатамінотрансфераза
ВМК – вітамінно-мікроелементний комплекс
ГГЦ – гіпергомоцистеїнемія
ГП – гідроперекиси
ГЦ – гомоцистеїн
КГ – карбонільні (кето-) групи
МДА – малоновий діальдегід
ОД – основна дієта
ПП-1 – препарат порівняння 1
ПП-2 – препарат порівняння 2
СМ – середні молекули
СОД – супероксиддисмутаза
ЦНС – центральна нервова система
0 комментариев