Молекулярно-генетические аспекты мультифакториальных заболеваний (бронхиальная астма и туберкулез)

1.2. Молекулярно-генетические аспекты мультифакториальных заболеваний (бронхиальная астма и туберкулез)

Развитие подавляющего большинства мультифакториальных заболеваний (МФЗ) происходит при сочетанном влиянии разнообразных факторов. МФЗ представляют группу болезней, развитие которых определяется неблагоприятным сочетанием полиморфных вариантов генов, контролирующих возникновение и патогенез заболевания в совокупности с определенными воздействиями факторов среды. Для МФЗ характерен ряд особенностей, которые с одной стороны, позволяют рассматривать эту группу патологий как модель изучения комплекса специфичных генов и экзогенных факторов, которые, взаимодействуя между собой, формируют норму реакции устойчивости человека к среде обитания [Гинтер, 2001; Бочков и др., 1984], а с другой - значительно осложняют обобщение данных для установления истинных генов подверженности сложнонаследуемых заболеваний. Например, существенное увеличение распространенности многих полигенных заболеваний (астма и связанные с атопией патологические состояния, туберкулез и др.) нельзя объяснить изменениями в генетической структуре за прошедшие десятилетия. Вероятно, что существующие генетические факторы, взаимодействующие с изменившимися условиями окружающей среды (снижение числа инфекционных болезней, повсеместная иммунизация, особенности питания и др.) вызывают повышенную восприимчивость популяции к вышеперечисленным заболеваниям [Organov, Maslennikova, 1999; Sengler et al., 2002]. Это пример того, как воздействие факторов внешней среды может значительно изменить положение порога подверженности к МФЗ [Фогель, Мотульски, 1990]. Кроме того, необходимо учитывать наличие сочетаний индивидуальных для каждой отдельно взятой популяции аллельных вариантов генов предрасположенности к заболеванию, что отражают различающиеся результаты анализа ассоциаций с МФЗ. Тем не менее, установление генов предрасположенности и изучение их совместной работы, выявление особенностей взаимодействия с факторами негенетической природы в развитии МФЗ, для которых пожизненный риск оценивается в западных популяциях порядка 60%, вызывает естественное стремление исследователей к пониманию механизмов нормальной и патологической реализации генетической информации [Пузырев, 2003].

Бронхиальная астма (БА) – широко распространенное хроническое заболевание дыхательных путей, поражающее в России от 3 до 12 %, а в некоторых промышленно-развитых регионах эти цифры достигают 30 % [Научно-практическая программа «Бронхиальная астма у детей: диагностика, лечение и профилактика», 2004], а также порядка 5 миллионов детей и 10 миллионов взрослых в Западных странах [Schwartz et al., 2004]. Кроме того, отмечено повышение уровня числа больных, требующих госпитализации, а также рост показателей смертности от астмы. Несмотря на явные успехи в области выявления и лечения данной патологии, распространенность и тяжесть заболевания значительно увеличиваются за последние десятилетия.

Драматическое увеличение распространенности и тяжести астмы на протяжении последних 20 лет, особенно в ряде промышленных регионов предполагает, что ухудшающиеся условия окружающей среды играют далеко не последнюю роль в развитии и прогрессировании данной патологии. Отмеченное влияние ряда факторов, например, возраст, раса, социально-экономический статус, хотя и предполагает их участие в риске развития БА, но все-таки особую роль в этиологии и патогенезе заболевания отводят влиянию аллергенов, курению, профессиональным химическим агентам, загрязнителям воздуха, вирусам и иммунизации против конкретного инфекционного заболевания.

В 90% случаев выявления больных бронхиальной астмой присутствует атопия как генетически детерминированная способность организма к выработке повышенного IgE в ответ на воздействие аллергенов окружающей среды. Через IgE-опосредованный механизм целый ряд клеточных элементов: гистиоциты (тучные клетки), макрофаги, лимфоциты, эпителиальные и эндотелиальные клетки независимо друг от друга или совместно принимают участие в воспалении дыхательных путей, тем самым, осуществляя иммунный ответ организма на внедрение антигена. Воспалительная природа заболевания проявляется в морфологи­ческих изменениях стенки бронхов - дисфункции ресничек мерцатель­ного эпителия, деструкции эпителиальных клеток, инфильтрации клеточными элементами, дезорганизации основного вещества, гиперпла­зии и гипертрофии слизистых и бокаловидных клеток. Длительное течение воспалительного процесса приводит к необратимым морфофункциональным изменениям в виде резкого утолщения базальной мембраны, нарушения микроциркуляции и склероза стенки бронха. Ключевой особенностью астмы является состояние бронхиальной гиперреактивности, свидетельствующее о повышенном бронхоконстрикторном ответе на различные физико-химические факторы, включая не только аллергены, к которым сенсибилизирован индивид, но и специфические стимулы, например, холодный воздух и физическая нагрузка [Гриппи, 1997]. Формирование гиперреактивности связывают с перестройкой дыхательных путей, обусловленной хроническим аллергическим воспалением, сопровождающейся сужением стенок, повышением васкуляризации, гипертрофией и гиперплазией гладкой мускулатуры бронхов. В результате чего происходят изменения нейрональной регуляции и повышение сократимости гладких мышц дыхательных путей. Как и атопия, неспецифическая гиперреактивность являются одними из универсальных признаков астмы: чем выше эти показатели, тем тяжелее протекает процесс. Однако распространенность бронхиальной гиперреактивности значительно выше, чем БА.

На протяжении более чем столетней истории вопроса наследования БА обсуждались различные модели – моногенные (аутосомно-рецессивная и доминантная), полигенные, сцепленные с половыми хромосомами [Huang, Marsh, 1993; Чучалин, 1999]. В ходе исследований стало понятно, что сложные механизмы наследования астмы (как и атопии) не могут быть объяснены простой (моногенной) моделью, а проявление клинических симптомов болезни является результатом действия средовых факторов на предрасположенных индивидуумов [Anderson, Cookson, 1999].

Для оценки генетического вклада в этиологию и патогенез БА были предприняты массовые близнецовые исследования в Швеции, Финляндии, Норвегии, Дании, США и Австралии, показавшие оценку наследуемости от 15 до 75 %, что подтвердило предположение о генетической основе заболевания [Edfors-Lubs, 1971; Duffy et al., 1990; Nieminen et al., 1991; Lichtenstein, Svatengren, 1997; Laitinen et al., 1998; Skadhauge et al., 1999].

Большинство современных исследователей рассматривают генетическую компоненту заболевания БА как полигенную систему с аддитивным эффектом отдельных генов, каждый из которых в отдельности не способен, либо крайне редко способен вызвать болезнь [Holgate et al., 1995; LeSouef, 1997]. Таким образом, БА, как и многие распространенные заболевания в популяции, рассматривается как полигенная болезнь с наследственной предрасположенностью или как мультифакториальная болезнь. Для астмы, как и для остальных заболеваний этой группы характерны следующие признаки, сформулированные в 1969 году C.O. Carter: а) относительно высокая частота болезни в популяции и в то же время значительная семейная подверженность; б) наличие патогенетических и ассоциированных маркеров предрасположения; в) хроническое течение и наличие форм, образующих непрерывный ряд проявлений от ярко выраженных до субклинических; г) более раннее начало заболевания и утяжеление клинических симптомов в нисходящих поколениях семьи; д) относительно невысокая (в сравнении с моногенными болезнями) конкордантность по заболеванию у монозиготных близнецов; е) повышенный риск повторного рождения предрасположенных к болезни детей с появлением каждого последующего пораженного болезнью ребенка; ж) однотипность проявлений болезни у больного ребенка и ближайших родственников, что отражает коэффициент наследуемости, превышающий 50–60%; з) несоответствие закономерностей наследования болезни простым менделевским моделям (доминантное, рецессивное и др.) [Carter, 1996].

Таким образом, достижения в области исследования важнейших механизмов развития астмы позволили выработать концепцию патогенеза БА, согласно которой в основе клинических проявлений болезни лежит атопия, которая, как известно, характеризуется значительным вкладом наследственных факторов. А тщательная оценка эпидемиологии астмы позволяет определить экологические факторы риска БА.

Существует мнение, что контакт с бактериальными и вирусными инфекциями в раннем детстве является защитным фактором к дальнейшему развитию атопического заболевания в более поздней жизни. Еще в 1989 г. Strachan заметил, что распространение сенной лихорадки среди взрослых находится в обратной связи с размером семьи и даже более того – с наличием братьев и сестер [Strachan, 1989]. В связи с чем была выдвинута гипотеза, предполагающая, что инфекции в раннем детстве оказывают защитный эффект против развития в дальнейшем аллергии, получившая в последующем название «гигиенической гипотезы». С момента этого наблюдения выполнено много исследований, посвященных изучению связи между инфекциями, перенесенными в раннем периоде жизни и последующим развитием атопических заболеваний [Noguchi et al., 1998; Heinzmann et al., 2000]. Воссоединение Германии в 1990 г. способствовало уникальной возможности изучать распространение астмы в генетически схожих популяциях, но в условиях воздействия различных факторов окружающей среды, в том числе инфекции. Несмотря на то, что дети из бывшей Восточной Германии чаще болели инфекциями верхних дыхательных путей по сравнению с Западной Германией, развитие астмы в этих двух популяциях имело обратную зависимость [von Mutius et al., 1994]. В контексте «гигиенической гипотезы» интересны исследования, в которых показано, что дети, выросшие на ферме в тесном контакте с сельскохозяйственными и домашними животными, реже имели сенсибилизацию к пыльцевым и другим атопическим аллергенам в сравнении с детьми, выросшими в другой среде. Эти результаты указывают на то, что окружающая среда, характеризующаяся высоким содержанием бактерий, может действительно защищать от развития аллергии, по крайней мере, если субъект в раннем возрасте находился в такой среде. Основным механизмом данного защитного действия является способность эндотоксинов, содержащихся в бактериально загрязненной домашней пыли, стимулировать Th1-иммунитет [Ильина, 2001].

На сегодняшний день показано сцепление БА и ее клинических проявлений со многими хромосомными регионами. Изучение кандидатных генов показало сцепление с атопией и бронхиальной гиперреактивностью по многим локусам, но наибольшая важность показана для регионов 5q, 6p, 11q, 12q, 13q, 14q, 16p, и именно для этих локусов получены воспроизводимые результаты (табл. 2).

Таблица 2

Гены-кандидаты бронхиальной астмы и связанных с ней клинических фенотипов

В отношении астмы проведено 13 полногеномных исследований (в том числе исследование в различных расовых группах), в результате чего было подтверждено сцепление БА с регионами 5q23-31, 6p21-23, 12q14-24, 13q21-qter и 14q11-13, а также определена важность новых регионов астмы 2q33, 5p15, 11p15, 17p11, 19q13, 21q21 [Daniels et al., 1996; The Collaborative Stady on the Genetics of Asthma, 1997, 2004; Ober et al., 1998; Hizawa et al., 1998; Wjst et al., 1999; Yokouchi et al., 2000; Cookson et al., 2001; Koppelman et al., 2002]. Полученные данные еще раз свидетельствуют в пользу того, что в этиологии и патогенезе БА задействовано исключительное множество генов, каждый из которых в отдельности может вносить лишь относительно небольшой вклад в общую генетическую подверженность к заболеванию.

Изучение этиологии и патогенеза БА показало важную роль в формировании этого заболевания интерлейкинов (ИЛ), ответственных за индукцию и поддержание воспаления при данной патологии [Chung, Barnes, 1999]. Интересным фактом оказалось то, что гены цитокинов, играющих существенную роль в патогенезе БА расположены тандемно в одном кластере на хромосоме 5q31-33 [Arai et al., 1990]. На сегодняшний день показана связь БА и ее клинических проявлений со многими генами ИЛ и их рецепторов [Nanavaty et al., 2001] Так, сотрудниками лаборатории популяционной генетики НИИ медицинской генетики (г.Томск) совместно с кафедрой факультетской педиатрии с курсом детских болезней (заведующий – д.м.н., профессор Огородова Л.М.) лечебного факультета Сибирского государственного университета в рамках работы по изучению генетической компоненты подверженности к БА была показана ассоциация аллеля С-703 гена IL5 с этим заболеванием, характеризующимся бронхиальной гиперреактивностью [Фрейдин и др., 2000]. Кроме того, установлено, что генотип G/G 3’-UTR гена IL4 является фактором риска тяжелого течения заболевания, а гетерозиготный генотип G/С 3’-UTR этого же гена – протективным фактором, ассоциированным с легкой астмой [Огородова и др., 2002; Freidin et al., 2003]. Анализ вклада генотипической изменчивости по генам ИЛ и их рецепторов в фенотипическое варьирование количественных, патогенетически значимых для БА признаков показал, что гены ИЛ и их рецепторов по отдельности определяют 2-5% общей фенотипической дисперсии количественных показателей (1,63-5,54% у мужчин и 1,03-2,15% у женщин) [Фрейдин и др., 2003].

К настоящему моменту накапливаются результаты работ, посвященных анализу связи полиморфизма генов системы ферментов метаболизма ксенобиотиков с атопическими заболеваниями (табл. 3). Многолетние исследования, проводимые в НИИ молекулярной биологии и биофизики СО РАМН (г. Новосибирск) и в НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта (г. Санкт-Петербург) показали связь полиморфизма генов системы ферментов метаболизма с формированием предрасположенности к БА и особенностей ее клинического фенотипа.

Малочисленность имеющихся данных о значимости генов системы метаболизма ксенобиотиков для БА, а также их противоречивый характер, свидетельствуют о чрезвычайной актуальности таких исследований, так как относительно генов метаболизма в ряде случаев, возможно точно установить факторы, обусловливающие их патологический эффект [Ляхович и др., 2000; Schwartz et al., 2004].

Таблица 3

Связь полиморфных вариантов генов ферментов метаболизма ксенобиотиков с бронхиальной астмой и ее клиническими проявлениями

Обобщая вышеизложенное необходимо отметить, что полученные данные позволили значительно продвинуться в определении генов, полиморфизм которых, возможно играет существенную роль в развитии заболевания. Однако вследствие сложного клинического фенотипа БА, полигенной модели наследования и значительной роли воздействий внешней среды в развитии и прогрессировании этого заболевания, большее число генов подверженности к астме до сих пор остается до конца не идентифицированным и требует дальнейшего исследования.

Туберкулез (ТБ) – одно из самых распространенных инфекционных заболеваний, характеризующееся преимущественно хроническим течением различных клинических форм, своеобразием специфических иммунологических и морфологических проявлений. Проникновение в организм возбудителя ТБ является необходимым, но недостаточным условием для развития болезни, и в патогенезе ТБ взаимосвязаны взаимодействие инфекционного агента, факторы среды и особенности организма хозяина (пол, возраст, сопутствующие заболевания, общая реактивность организма и т.д.). ТБ отличается клиническим полиморфизмом, который определяет различные формы заболевания – от малых с бессимптомным течением до обширных деструктивных процессов в легких с выраженной клинической картиной, а также наличием туберкулезного процесса различной локализации в других органах [Хоменко, 1990]. По-видимому, причины таких различий обусловлены не только неблагоприятным сочетанием внешних факторов, но и особенностями организма, обусловленными его генотипом. Так, отмечено, что некоторые индивиды проявляют врожденную относительную резистентность к ТБ [Авербах, 1976]. Благодаря этому заболевает лишь малая часть населения, в то время как, по данным ВОЗ, инфицируется практически каждый третий житель планеты [Шайхаев, 1999].

По результатам популяционных исследований были показаны этнические различия в развитии ТБ [Рудко и др., 2004; Cervino et al., 2000; Bellamy et al., 1998]. Возможно, что этнические различия в предрасположенности к заболеванию обусловлены определенными традициями популяций, экономическими причинами и др. Кроме того, накоплены данные о высокой подверженности к ТБ популяций, происходящих с территорий свободных от этого заболевания: случаи заболевания были особенно высоки в популяциях, ранее не встречавшихся с этим заболеванием [Bellamy et al., 1998; Stead, 1992]. Эти данные подтверждают гипотезу, выдвинутую еще в 1949 г. Haldane о том, что инфекционные заболевания были главной силой естественного отбора, а резистентность к туберкулезной инфекции формировалась в процессе симбиотных отношений макро- и микроорганизмов [Земскова, 1984].

На сегодняшний день показана роль в подверженности к ТБ для многих генов, в том числе HLA-cистемы, NRAMP1, IFN-γ и его рецептора и др. Одним из главных генов-кандидатов туберкулеза является NRAMP1 (от англ. Natural-Resistance-Associated Macrophage Protein 1 gene – ген макрофагального белка, ассоциированного с естественной резистентностью 1) [Bellamy et al., 1998]. Белковый продукт этого гена Nramp1 участвует в процессах активации макрофагов, являясь ключевым звеном в механизме транспорта нитритов из внутриклеточных компартментов в более кислую среду фаголизосомы, где он способен вступать в химическую реакцию с образованием NO. Белок входит в семейство функционально связанных мембранных белков (к этому семейству относят также Nramp2), ответственных за транспорт двухвалентных катионов, таких как Fe2+, Mn2+, Zn2+, Cu2+ [Canonne-Hergaux et al., 1998]. Поэтому, нарушение работы системы, обеспечивающей транспорт важных веществ через мембрану, приводит к дисбалансу между выведением и поступлением веществ в клетки, что может способствовать изменению внутриклеточной концентрации ионов, вызывающей гибель клеток. Предполагаемый механизм антибактериальной функции Nramp1 лежит в создании неблагоприятной для бактерии окружающей среды внутри фагосомы [Пузырев и др., 2002]. Следовательно, дефекты продукции или функции Nramp1 могут приводить к нарушению его транспортной роли и, как следствие, к повышению чувствительности к внутриклеточным патогенам, таким как микобактерии.

Многочисленные работы на экспериментальных животных показали, что NRAMP1 играет важную роль в чувствительности к микобактериям и некоторым другим возбудителям инфекций у мышей, и вероятно, что его человеческий гомолог связан с подобными инфекциями у людей [North, Medina, 1998]. Для определения функции гена NRAMP1 в развитии ТБ были проведены исследования в различных популяциях: у западных африканцев в Гамбии, местного населения в Корее и Японии [Bellamy et al., 1998; Ryu et al., 2000; Gao et al., 2000]. В результате было обнаружено, что изменчивость данного гена связана с различиями в восприимчивости к ТБ. Связь полиморфных маркеров гена NRAMP1 в дальнейшем была подтверждена на семейном материале у больных ТБ родственных между собой индивидов, проживающих на территории Гвинеи-Конакри [Cervino et al., 2000]. Результаты клинико-генетических исследований и изучение ассоциаций ряда маркеров с заболеванием ТБ сформировали единое мнение, что восприимчивость к данной болезни находится под полигенным контролем, а отдельный вклад гена NRAMP1 – лишь небольшая доля в общей подверженности к инфекционному заболеванию [North, Medina, 1998].

Другой генетической системой, задействованной в возникновении и патогенезе ТБ, считается комплекс HLA (от анг. Human Leukocyte Antigens). Комплекс HLA, как и его аналоги у животных, называют главным комплексом гистосовместимости, поскольку первой из обнаруженных функций этого комплекса был контроль над трансплантационным иммунитетом. Следует отметить, что комплекс генов HLA является чрезвычайно полиморфной системой. Первой работой в области исследования HLA системы при ТБ, где были получены положительные результаты, была работа R. Selby и соавт. (1978). Затем исследования были продолжены на популяционном и семейном материале, в ходе которых были получены противоречивые результаты. Ассоциации, показанные в одних популяциях, не находили своего подтверждения у других. В 1979 г. Al-Arif с соавт. показали значимое повышение встречаемости у больных ТБ легких антигена В15 в популяции американских негров [Al-Arif et al., 1979]. Позднее Jiang с соавт. обнаружили высокую частоту встречаемости антигена HLA-В27 среди заболевших ТБ китайцев [Jiang et al., 1983].

Отечественными исследователями также была проведена большая работа по изучению значимости HLA системы при заболеваемости ТБ в разных этнических группах, проживающих на территории России. В ходе работы была установлена повышенная частота встречаемости антигенов локуса HLA-B12,-С в узбекской и туркменской популяциях. У русских с ТБ легких в локусе HLA-В антигены В5, В14 встречались значимо чаще, но особенно интересным показался тот факт, что во всех трех популяциях показана ассоциация HLA-C локуса с заболеванием [Литвинов и др., 1983, 1986; Хоменко и др., 1985]. Следовательно, во всех изучаемых популяциях установлена взаимосвязь между некоторыми генетическими маркерами системы HLA и восприимчивостью к туберкулезу, причем в разных популяциях – с разными антигенами. В большинстве исследуемых популяций определены ассоциации заболевания ТБ с одним и тем же антигеном локуса DR (DR2), и учитывая, что гены комплекса HLA-DR отвечают за иммунный ответ, предполагается, что данный локус оказывает влияние на восприимчивость к ТБ, регулируя силу иммунного ответа на микобактериальные антигены [Поспелов и др., 1987; Хоменко, 1990]. В целом, гены, составляющие комплекс HLA, являются важными факторами патогенеза данного инфекционного заболевания. Об этом свидетельствует целый ряд многократно подтвержденных фактов: ассоциация определенных генов HLA (преимущественно DR и B-локусов) с заболеванием в большинстве обследованных популяций, сцепление гаплотипов HLA в семьях с пораженными родителями и детьми, ассоциации со специфичными антигенами у больных с хроническим, плохо поддающимся лечению процессом.

К настоящему моменту роль в подверженности к ТБ для генов рецептора к витамину D, γ-интерферона и его рецептора, фактора некроза опухолей, интерлейкинов и др. не вызывает сомнения [Bornman et al., 2004]. Интерес к системе генов метаболизма ксенобиотиков в отношении ТБ обусловлен несколькими причинами. Во-первых, данные, что при воспалении и инфекции происходит изменение уровня активности цитохромов Р450, предполагают задействование системы метаболизма в защите организма от последствий развертывания воспалительных реакций при заболевании [Prandota, 2002; Сибиряк, 2003; Бикмаева и др., 2004]. Во-вторых, знания об участии ферментов системы метаболизма в биотрансформации лекарственных препаратов, позволяют найти и избежать причины, определяющие нежелательные проявления терапевтического действия лекарств. В этом контексте определение генетической компоненты подверженности к проявлению многообразных побочных реакций при применении антимикобактериальных препаратов при ТБ имеет очень важное значение для достижения успехов в терапии заболевания [Dickinson et al., 1981; Roy et al., 2001; Huang et al., 2002, 2003].

Сложность патогенеза, а так же различия в клиническом проявлении ТБ предполагают, что число генов-кандидатов заболевания достаточно велико, при этом вклад каждого из них в суммарную подверженность различен [Hill, 1998]. И поэтому изучение полиморфизма известных генов-кандидатов, а также поиск новых генов, белковые продукты которых в той или иной степени вовлечены в патогенетические механизмы заболевания, представляется одной из приоритетных задач.