Полиморфизм генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков и патология

1.3. Полиморфизм генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков и патология

Известно, что многие бронхолегочные патологии в различной степени связаны с развитием окислительного стресса. Эпителий легкого, насыщенного кислородом внешней среды, чрезвычайно восприимчив для токсического действия радикалов экзогенного и эндогенного происхождения. Высокая частота заболеваний бронхолегочной системы (астма, эмфизема, пневмония и др.) находится в прямо пропорциональной зависимости от уровня загрязнения окружающей среды сильными окислителями (NO, NO₂, CO, O₃, альдегиды), пылевыми частицами в совокупности с воздействием экстремальных климатических условий [Гусев, Даниловская, 1987; Mutmansky, 1990; Тиунов и др., 1991]. Состояние окислительного стресса и разрушающее воздействие свободнорадикального окисления имеет значение не только в возникновении заболевания, а также может являться важнейшей причиной дальнейшей хронизации патологического процесса в легочной ткани [Меньщикова, Зенков, 1991].

Известно, что источниками активированных кислородных метаболитов могут быть как внешние факторы (альдегиды, озон, окислы азота, сигаретный дым, анаэробные бактерии), так и эндогенные, задействованные во внутриклеточных метаболических процессах (альвеолярные макрофаги, гранулоциты, внутриклеточные органеллы). Воздействие атмосферных прооксидантных поллютантов, таких как озон, окислы азота, составляющих табачного и автомобильного дыма на дыхательные пути приводит к индуцированию окислительных процессов, как на поверхности бронхоальвеолярного секрета, так и непосредственно в эпителии легкого [Wright et al., 1994]. Присутствие разнонаправленных повреждающих воздействий оксидативного стресса говорит о важности для организма поддержания баланса системы активированных кислородных метаболитов в легких.

Эффективной защитой от различных токсикантов внешней среды, поступающих с вдыхаемым воздухом, служит система биотрансформации ксенобиотиков при согласованном функционировании защитных механизмов. Глутатион S-трансферазы – семейство ферментов, участвующих в метаболизме большого числа электрофильных ксенобиотиков через конъюгацию с глутатионом, а также в метаболизме ряда эндогенных субстратов (гормонов, липидов, простагландинов, лейкотриенов). Таким образом, метаболизм ксенобиотиков через глутатионопосредованную детоксикацию играет важную роль в обеспечении устойчивости клеток к перекисному окислению жиров, свободным радикалам, алкилированию белков, в формировании резистентности к лекарственным препаратам и предотвращении поломок ДНК.

В результате однонуклеотидной замены аденина (А) на гуанин (G) в гене GSTP1, приводящей к замене аминокислот изолейцина (Ile105) на валин (Val105), происходит изменение ферментативной активности, обусловливающее повышение уровня гидрофобных аддуктов в тканях легких и полициклических ароматических углеводородов-ДНК аддуктов в лимфоцитах крови. Было выявлено, что замена изолейцина на валин в 105 положении расположенная в субстрат-связывающем Н участке фермента, приводит к различным изменениям кинетических параметров фермента [Katoh et al., 1999]. Показано, что при мутации Val105 в 7 раз увеличивается каталитическая активность фермента по отношению к полициклическим ароматическим соединениям, но в 3 раза снижается активность по отношению к 1-хлор-2,4-динитробензену [Ishii et al., 1999]. Отмечено, что индивидуумы с аллелем Val105 имеют повышенный риск развития РЛ [Баранов и др., 2000].

К настоящему времени накоплено достаточно сведений об ассоциации «нулевого» генотипа гена GSTM1 с риском развития эмфиземы легких и хроническим бронхитом у курильщиков [Афанасьева, Спицин, 1990], кроме того, показана повышенная частота «нулевого» генотипа, помимо GSTM1, и для гена GSTT1 у больных БА [Баранов и др., 2000]. Микросомальная эпоксигидролаза (EPHX1) осуществляет метаболизм продуктов табачного дыма, и поэтому играет важное значение в защите легких от высокоактивных производных эпоксида, образующихся при курении и приводящих к повреждению легочной ткани курильщиков. Показано, что с аллелем S гена EPHX1, обеспечивающим пониженную активность соответствующего фермента, ассоциированы заболевания органов дыхания, такие как эмфизема легких, хронический обструктивный бронхит, муковисцидоз, хронические респираторные заболевания [Баранов и др., 2000; Lomas, Silverman, 2001; Matsushita et al., 2002; Sandford, Silverman, 2002].

Многочисленные исследования полиморфных вариантов генов системы метаболизма ксенобиотиков показали связь с различными заболеваниями, включая сердечно-сосудистую патологию, атопические заболевания, хронические неспецифические заболевания легких и др. Но, прежде всего, пристальное внимание исследователей к индивидуальным особенностям функционирования системы биотрансформации отмечено при онкологических заболеваниях. Это понятно, так как уже доказано влияние большинства химических агентов, с которыми человеку приходится сталкиваться как в быту, так и на производстве, на процессы канцерогенеза.

Исследование полиморфизма 313 A>G гена GSTP1 у японцев с различными онкологическими патологиями (рак ротовой полости, легких, желудка, колоректальным и урогенитальным видами рака) показало ассоциацию только у некурящих индивидуумов с раком ротовой полости (РРП), для остальных видов рака различий не было выявлено [Katoh et al., 1999]. В другой работе была изучена роль полиморфного варианта C341T гена GSTP1 как важного фактора, обусловливающего развитие РРП, где был показан повышенный риск развития данной патологии, как для европеоидов, так и для афроамериканцев. Интересен тот факт, что более высокий риск развития заболевания наблюдался у пациентов с малым потреблением табака (< или = 20 пачка/год) по сравнению с группой интенсивных курильщиков (>20 пачка/год) [Park et al., 2000].

 Генетическая предрасположенность – одна из важных гипотез, объясняющих, почему лишь у малого числа курильщиков развивается рак легкого (РЛ). Полиморфизмы, участвующие в метаболизме канцерогенов изучаются как факторы риска для рака легкого. Полиморфизм в гене GSTM1, также как и в гене GSTT1, обусловлен протяженной делецией, в результате которой происходит полное отсутствие ферментативной активности. В ряде работ показано, что функциональную значимость в развитии онкопатологии может иметь не один конкретный рисковый генотип, а их специфическая комбинация. Было отмечено, что повышенный риск РЛ у курильщиков европеоидной расы имеют индивиды с комбинацией генотипов GSTM1-нуль, GSTP1 AG+GG и GSTM3 AA (n=322) [Jourenkowa-Mironowa et al., 1998]. Другое исследование также выявило связь развития РЛ у индивидов с «нулевым» генотипом гена GSTM1 в присутствии р53 Pro аллеля [Miller et al., 2002]. Предположительно, что потенциальное взаимодействие между GSTP1 и GSTM1 генами в японской популяции у мужчин-курильщиков (n=542) в возрасте 50-69 лет приводит к повышенному риску РЛ при комбинации одного из вариантов аллелей GSTP1 и нулевого генотипа гена GSTM1 [Kihara, Noda, 1999]. Выявлен повышенный риск РЛ среди курильщиков в популяционных выборках Средиземноморья, 93% которых составили мужчины с комбинацией «нулевого» генотипа гена GSTM1 и р53 Pro/Pro+Arg/Pro генотипов [To-Figueras et al., 1996].

Предположительное влияние изотиоцианатов – компонентов, обладающих антиканцерогенными свойствами и содержащихся в крестоцветных овощах, в снижении регуляции уровня ферментов биотрансформации семейства цитохромов Р450 и индукции ферментов второй фазы детоксикации, легло в основу исследования GSTM1 и GSTT1 генотипов у больных с впервые выявленным РЛ. В ходе исследования было показано модифицирующее влияние употребления в пищу изотиоцианатов у курильщиков гомозиготных по «нулевым» генотипам GST на развитие рака легкого [Spitx et al., 2000].

Миелодиспластический синдром (МДС) – клональное пролиферативное нарушение костного мозга, часто прогрессирующее в острую миелоидную лейкемию (ОМЛ), а заболеваемость и смертность от МДС одинакова и составляет период менее года. Воздействие различных по качественному и количественному составу химических веществ, с которыми приходится сталкиваться индивидуумам по роду профессиональной деятельности, на процессы канцерогенеза может увеличивать вероятность заболеваемости МДС. Повышенный риск МДС отмечен у лиц, проходивших курс химиотерапии при лечении других опухолей. Вследствие индивидуальных различий в метаболизме ксенобиотиков (в том числе и канцерогенов) возможно увеличение риска раковых заболеваний при сниженной функции метаболизирующих ферментов. Конъюгация электрофильных компонентов с глутатионом, опосредованная глутатион S-трансферазами, является важным этапом метаболизма канцерогенов. Известно, что частота «нулевого» генотипа гена GSTM1 среди европеоидов составляет порядка 50% и данный генотип ассоциирован с развитием РЛ, индуцированного курением, а также раком мочевого пузыря. О взаимосвязи «нулевого» генотипа гена GSTT1 с различными раковыми заболеваниями известно намного меньше, но ясно, что у индивидуумов с «нулевым» генотипом снижена способность к метаболизму некоторых канцерогенов, включая 1,3-бутадиен, метилбромид, оксид этилена. Был установлен четырехкратный относительный риск МДС для носителей «нулевого» генотипа GSTT1 [Chen et al., 1996].

Предполагается, что нулевой генотип гена GSTT1, ассоциированный с канцероген-индуцированными хромосомными изменениями в лимфоцитах, может увеличивать риск подверженности к миелодисплазии. При анализе данных, полученных в ходе исследования пациентов с острой миелоидной лейкемией (ОМЛ), была показана повышенная частота делеции в гене GSTT1 среди больных (60%), что практически в три раза выше, чем в контрольной группе (17%), кроме того, индивиды с делецией по генам GSTT1 и GSTM1 имели несколько больший риск ОМЛ. Интересно, что у лиц со вторичной ОМЛ делеция GSTT1 встречается на 20% чаще по сравнению со случаями de novo, что характерно и для индивидов с «нулевым» генотипом гена GSTM1 [Cramp et al., 2000].

Возможно, что эффекты определенных генотипов генов ферментов биотрансформации различны в развитии рака и других заболеваний. В связи с этим предложено, что продукты, образующиеся в ходе метаболизма ряда ксенобиотиков с участием глутатионовых S-трансфераз, способствуют атерогенезу и нестабильности тромбоцитов. В дальнейшем было показано, что «нулевой» генотип гена GSTM1 играет протективную роль в развитии инфаркта миокарда, причем эффект более выражен у курильщиков [Wilson et al., 2000]. Вероятно, что наличие «нулевого» генотипа по генам GST способствует повышенной регуляции других ферментов, более эффективно участвующих в метаболизме атерогенных субстратов с учетом одного из важных качеств системы биотрансформации, а именно широкой субстратной специфичности. По этому поводу имеются данные о скоординированной экспрессии GSTM1 и GSTM3 в легочной ткани человека [Anttila et al., 1995], а также о более высокой активности CYP1A2 у индивидуумов с нулевым генотипом GSTM1 [MacLeod et al., 1997].

Глутатионопосредованная детоксификация принимает непосредственное участие в защите организма от оксидативного стресса, что оправдывает изучение полиморфизма генов глутатион S-трансфераз в патогенезе различных патологических состояний, в том числе и при эндометриозе. Так, у больных эндометриозом женщин Башкортостана отмечаются различия по частотам как отдельных генотипов полиморфных локусов GSTM1 и GSTP1, так и по распределению частот их сочетаний. Кроме того отмечено, что более выраженный эффект от гормонального лечения наблюдался у лиц, имеющих «нулевой» генотип гена GSTM1 в сочетании с мутацией по гену GSTP1 [Шарафисламова и др., 2003].

N-ацетилтрансфераза-2 (NAT2) и микросомальная эпоксигидролаза (EPHX1) полиморфные гены ферментов, метаболизирующих различные канцерогены табачного дыма. Табачный дым содержит >4000 компонентов, включая около 50 канцерогенов, являющихся субстратами семейства ферментов биотрансформации. Для понимания роли этих двух полиморфизмов во взаимодействии «ген-окружающая среда» в развитии РЛ было проведено исследование, в ходе которого было обнаружено, что риск развития заболевания значительно повышается с увеличением значения «пачка-лет» у курильщиков. Результаты данного исследования еще раз показали очевидность того, что изучение взаимоотношения генетического полиморфизма с факторами окружающей среды в формировании повышенного риска онкологической патологии, имеет состоятельность только тогда, когда внешнесредовой фактор является неотъемлемой составляющей частью патогенетического механизма (например, курение), и он обязательно включается в анализ [Zhou et al., 2002].

Ген CYP17 кодирует фермент цитохром Р450С17a, который выполняет две различные функции в биосинтезе стероидов, что обусловливает его изучение как гена кандидата восприимчивости к эндокринзависимым опухолям. Тем не менее, были получены довольно противоречивые результаты при исследовании пациентов с раком яичников и полиморфизма Т-С в промоторном регионе CYP17 гена в различных популяциях [Spurdle et al., 2000]. Что еще раз подтверждает популяционную вариабельность полиморфизма генов биотрансформации, и, следовательно, различный вклад генов системы метаболизма у разных индивидуумов в процессы онкогенеза.

Ген CYP1A1 человека был клонирован и секвенирован в 1986 году и локализован на хромосоме 15. Полиморфизм в 3’-некодирующем регионе гена, обусловленный заменой цитозина на тимидин, узнаваемый MspI эндонуклеазой рестрикции был впервые идентифицирован у японцев. Различные исследования показали ассоциацию данного полиморфизма и риском развития РЛ в европеоидной популяции [Shields et al. 1993; Alexandrie et al., 1994; Sugimura et al., 1994]. Эти результаты сходны с данными, полученными в аналогичной работе по изучению злокачественного новообразования в легких для японской популяции [Xu et al., 1996].

Употребление алкоголя в больших дозах рассматривается как один из факторов, способствующих развитию различных заболеваний печени. Так, отмечен высокий риск развития гепатоцеллюлярной карциномы (ГЦК) у японцев, злоупотребляющих алкоголем. Причем, наблюдалась повышенная частота С2 аллеля гена CYP2E1, связанного с высокой транскрипционной и ферментативной активностью, что также позволяет говорить о повышенном риске к ГЦК у индивидуумов, злоупотребляющих алкоголем [Munaka et al., 2003].

Развитие алкогольного поражения печени (АПП) на фоне алкогольной интоксикации всего организма является следствием несостоятельности ферментативной системы биотрансформации ксенобиотиков, участвующей в метаболизме этанола. Метаболизм этанола происходит в печени, где метаболизируется порядка 98% попавшего в организм алкоголя по НАДФ-зависимому пути с помощью алкогольдегидрогеназы и ацетилдегидрогеназы, локализованных преимущественно в цитоплазме клеток печени. Существует и другой путь окисления этанола с помощью микросомальной этанолокисляющей системы при участии ферментов семейства цитохрома Р450. Шангареева З.А. и др. показали, что для пациентов, страдающих АПП характерно повышение частот мутантных аллелей генов CYP2E1, CYP1A1, mEPHX, GSTT1 и GSTM1, приводящее к увеличению рисковой значимости гетерозиготных генотипов генов CYP2E1 (OR=7,37), CYP1A1 (OR=2,87), mEPHX (OR=2,45) [Шангареева и др., 2003].

Начало или обострение псориаза, обусловленного Т-клеточным механизмом заболевания кожи с аутоиммуным характером заболевания, зачастую вызывается применением b-блокаторов и противомалярийных лекарственных препаратов. Предполагается, что метаболическая эффективность, обусловленная различными вариантами аллелей генов системы ферментов биотрансформации, может привести к накоплению ксенобиотиков или их реактивных метаболитов в органах-мишенях, а в дальнейшем неоантигены или неизвестные пептиды могут вызвать агрессивную реакцию со стороны Т-клеток. В этом контексте, было проведено исследование полиморфизма гена CYP2C19 у пациентов с псориазом. В ходе исследования было показано, что для гетерозиготных носителей по гену CYP2C19 (*1А и *2А) характерно более позднее развитие псориаза, в то время как эти же генотипы показали протективную роль для развития артрита, связанного с псориазом [Richter-Hintz et al., 2003].

Цитохромы P450 ответственны приблизительно за 75% метаболизма лекарственных препаратов и различных химических агентов. Человек имеет 59 активных генов, и 6 из них кодируют важные для лекарственного метаболизма ферменты. Приблизительно 40% цитохром P450-зависимого лекарственного метаболизма катализируются полиморфными ферментами, и такие «лекарство→P450» взаимодействия часто рассматриваются в отношении побочных действий лекарственных препаратов [Ingelman-Sundberg, 2004].

Экспрессия цитохрома P450 и связанная с ней биотрансформация изменяется при различных инфекционных заболеваниях. Следовательно, при развитии воспаления и инфекции в организме нарушена способность метаболизма печени и других органов, контролирующих действие лекарств. Содержание цитохрома Р450 и монооксигеназные активности в тканях этих органов снижаются при развитии бактериальных и вирусных инфекций, иммунизации различными антигенами, в условиях фармакологической иммуностимуляции, что опосредовано цитокинами. Депримирующее воздействие на цитохром Р450-зависимые монооксигеназы обнаружено у IFNa, IFNb, IFNg, IL-1 и TNF, IL-6, IL-11, IL-2. Цитокины угнетают транскрипцию генов и накопление мРНК различных изоформ цитохрома Р450 в клетках, возможно и посттранскрипционное угнетение синтеза белка некоторых изоформ [Renton, 2004]. Благодаря цитокиновой модуляции процессов монооксигенирования на цитохроме Р450, реализуется адаптация механизмов биотрансформации низкомолекулярных ксенобиотиков в условиях активации иммунной системы. Это обеспечивает, с одной стороны, защиту от последствий возможной неконтролируемой активации потенциально опасной для организма ферментной системы и снижение риска нарушения оксидантного равновесия, с другой - сохранение оптимального уровня и неогенез необходимых для адекватного "ответа" организма низкомолекулярных липофильных сигнальных молекул. Угнетение фармакометаболизирующей функции печени и изменение фармакодинамики и токсичности лекарственных препаратов необходимо учитывать при проведении терапии препаратами рекомбинантных цитокинов. В этом случае необходимо отметить, что ингибирование метаболизма различными препаратами также как влияние на концентрацию и/или число различных цитокинов в воспаленных тканях, может вызывать положительные эффекты у пациентов с различными заболеваниями, что позволит говорить о новых терапевтических возможностях лекарственных средств [Сибиряк, 2003].

Разнообразие элементов многокомпонентной и многоэтапной системы метаболизма имеет важное значение для фармакогенетики в плане разработки индивидуального подхода к лечению пациента. C помощью предупреждения индивидуального ответа на лекарственный препарат становится возможным повышение эффективности лечения и устранения нежелательных эффектов от медикаментозной терапии [Баранов и др., 2000].

Заключая обзор в целом, необходимо отметить, что изучение естественной изменчивости генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков у больных и членов их семей, а также установление их вклада в патогенез распространенных заболеваний, таких как БА и ТБ, стало задачей настоящего исследования. А понимание основных механизмов, участвующих в патогенезе заболеваний, поможет понять не только причины возникновения болезней, но и научиться бороться с ними.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ