Навигация
ЯМР-спектроскопия нуклеиновых кислот, полисахаридов и липидов
19053
знака
0
таблиц
14
изображений
Реферат
на тему:
«ЯМР-спектроскопия нуклеиновых кислот, полисахаридов и липидов»
Введение
Наряду с протеинами существуют и другие макромолекулы, которые выполняют важные биологические функции. Большинство методов ЯМР, используемых для исследования протеинов, могут быть при этом непосредственно перенесены на другие макромолекулы. В этой работе рассмотрим характерные особенности применения метода ЯМР для исследования нуклеиновых кислот, полисахаридов и липидов.
1. Состав и структура нуклеиновых кислот
Нуклеиновые кислоты занимают ключевую позицию в процессах хранения и передачи информации о наследственных свойствах организма. Как и протеины, они являются линейными макромолекулами, состоящими из небольшого числа различных фрагментов, нуклеотидов.
ЯМР нуклеиновых кислот в принципе сталкивается с теми же проблемами, что и ЯМР протеинов. В то же время определение пространственной структуры нуклеиновых кислот является более простой задачей, так как здесь выбор основной пары нуклеотидов существенно ограничивает число возможных пространственных структур.
Основными фрагментами дезоксирибонуклеиновых кислот являются дезоксирибонуклеотиды, а основными фрагментами рибонуклеиновых кислот – рибонуклеотиды. По аналогии с аминокислотами в протеинах эти фрагменты отличаются только своими боковыми цепями, которые в ДНК в основном состоят из пиримидиновых производных – цитозина и тимина – и пуриновых производных – аденина и гуанина. В РНК присутствуют те же боковые цепи, только основание тимин заменено на урацил. Кроме этих основных фрагментов нуклеиновых кислот имеется еще небольшое количество производных этих оснований – так называемые редкие основания.
ДНК представляет собой двойную спираль, образованную двумя переплетающимися нитями. Она может существовать в нескольких различных формах, значение которых для процессов регуляции и контроля передачи наследственной информации в дальнейшем будет подробно обсуждаться. РНК, как правило, существует в виде мономера. Основными формами РНК являются матричная РНК, транспортная РНК и рибосомная РНК. Как ДНК, так и РНК вступаете разнообразные взаимодействия с протеинами, в результате чего происходит либо считывание информации, либо ее регуляция. Дополнительно ДНК в эукариотических клетках образуют ассоциаты с протеинами: гистонами, которые участвуют в строительстве хромосом. Подобные взаимодействия демонстрируют РНК, например рРНК связывается с протеинами, из которых состоят рибосомы. В процессах расшифровки и передачи информации мРНК и тРНК вступают в разнообразные взаимодействия с ферментами, участвующими в этих процессах. Поэтому ясно, что исследование взаимодействий между протеинами и нуклеиновыми кислотами является одной из самых интересных областей применения метода ЯМР к биологическим задачам.
2. Исследование методом ЯМР нуклеиновых кислот и комплексов нуклеиновых кислот с протеинами
Применение метода ЯМР к исследованию нуклеиновых кислот обладает рядом особенностей по сравнению с исследованием протеинов. Так как основу нуклеотидов составляют ароматические системы, то имеет место достаточно сильная зависимость химических сдвигов от конформации молекул, что приводит к значительному усложнению спектров ЯМР. Основным фрагментом в последовательности нуклеиновых кислот является фосфатный остаток, так что ЯМР 31С наряду с ЯМР З может быть использован в качестве достаточно чувствительного метода исследований. Ионы Mg2+ связываются с тРНК и стабилизируют структуру. На рис. 3.40 показан пример спектра 31Р тРНК при различных концентрациях Mg.
В спектре С наблюдаются хорошо разрешенные линии, положение которых изменяется в зависимости от концентрации. Даже в одномерном спектре ЯМР *Н можно достаточно четко различить отдельные линии всех протонов иминогрупп, взаимодействующих между собой, и провести их отнесение. Эти протоны имеют более важное значение для определения структуры, так как именно их взаимодействие играет основную роль при определении структуры нуклеиновых кислот.
Последовательное отнесение резонансных линий и расчет трехмерной структуры проводят теми же методами, что и при исследовании протеинов. В принципе нуклеиновые кислоты могут принимать разнообразные формы. Главная цепочка фрагмента всегда характеризуется значениями шести торсионных углов, один из которых располагается в плоскости кольца рибозы, а значит, обладает ограниченной областью значений, которая зависит от четырех эндоциклических торсионных углов. Положение основания относительно рибозы определяется одним торсионным углом в гликозидной связи. Внутри рибозы спины всех протонов связаны косвенным спин-спиновым взаимодействием. Это означает, что отнесение резонансных линий, принадлежащих рибозному остатку, может быть проведено по методу COSY. Для основания константы косвенного спин-спинового взаимодействия, как правило, невелики, так что с ростом молекулярной массы основания их далеко не всегда удается зафиксировать. Внутри основания констаиты косвенного спин-спинового взаимодействия дают неполную информацию, поэтому следует дополнительно использовать ЯЭО. В отличие от протеинов отдельные фрагменты связаны скалярным взаимодействием через фосфатные группы, и в данном случае для расшифровки структуры можно воспользоваться значением константы гетероядерного косвенного спин-спинового взаимодействия 1З – 31С.
Анализ структуры резонансных линий в спектрах 31С фосфатной группы показывает, что имеется взаимодействйе. фосфора с протоном в положении 3', с протоном в положении 5' СН2-группы и 4' – протоном дезоксирибозы. Это означает, что проведя отнесение в спектре линии, соответствующей атому фосфора, связанному с этим протоном, можно найти линию, соответствующую протону в положении 4' следующего остатка. Правильность отнесения можно проверить, определив, какая из линий соответствует линии протона в положении 5'. Спектр З – 31Р – JH, полученный по методу RCT, позволяет отнести линии, соответствующие протонам в положениях 3' и 4', которые принадлежат двум соседним кольцам дезоксирибозы.
Информация, получаемая из значений констант спин-спинового взаимодействия и ЯЭО, отчасти является избыточной, так что спиновая система нуклеозида может быть определена достаточно надежно. Наряду с этим имеются зависящие от пространственной структуры данные по ЯЭО для последовательности, исходя из которых можно идентифицировать соседние нуклеотиды, а также данные по сильному ЯЭО для спаренных оснований комплементарных нитей.
Расчет структуры для двойной спирали ДНК относительно прост, так как вследствие спаривания оснований и регулярности структур уже имеются достаточно надежно подтверждаемые структурные гипотезы, среди которых необходимо провести выбор наиболее вероятной и затем уточнить структуру. Подобное справедливо также и для ДНК с одной спиралью или для РНК, еслиони обладают такой структурой, как, например, тРНК.
Если структура фрагмента ДНК известна и проведено отнесение резонансных линий, то можно изучить взаимодействие ДНК со специфическими протеинами. Примером этого может служить взаимодействие с протеином, который является лакрепрессором и подавляет транскрипцию лактозоспецифических ферментов, так что лактоза практически отсутствует в клетках. Структура головной части этого протеина, которая ответственна за связывание с ДНК, недавно была установлена методом ЯМР и опубликована в. По спектрам комплекса, полученным по методу NOESY, можно определить положение протеина относительно ДНК в том случае, если известно лишь несколько расстояний из измерений ЯЭО. Экспериментально по данным ЯЭО для 1Н для трех различных ароматических колец лак-репрессора найдены структуры, соответствующие определенным нуклеотидам лак-оператора. По этим оценочным значениям расстояний получена структура комплекса, в котором лак-репрессор развернут на 180° в сравнении со структурой, полученнной из модельных представлений.
Похожие работы
... Во-вторых, в настоящее время известно достаточное количество соединений, нерастворимых в неполярных растворителях или же, наоборот, хорошо растворимых в воде, которые, тем не менее, относят к липидам. В современной органической химии определение термина «липиды» основано на биосинтетическом родстве данных соединений — к липидам относят жирные кислоты и их производные [1]. В то же время в биохимии ...
... Methylobacillus flagellatum, галофильные бактерии Halobacterium methylicum и бациллы Bacillus subtilis. Целью настоящей работы было исследование процесса физиологической адаптации этих продуцентов БАС при росте на средах, содержащих максимальные концентрации тяжёлой воды. Поскольку биосинтетический потенциал используемых штаммов при росте на тяжелой воде к началу проведения данной работы ...
... , что существенно для синтеза 2Н-меченых БАС [30, 31]. Большой научно-практический интерес к использованию дейтерированной метилотрофной биомассы для синтеза продуцентов рибонуклеозидов определил цель настоящей работы, связанной с изучением принципиальной возможности биосинтеза 2Н-меченого инозина штаммом Bacillus subtilis за счет использования гидролизата факультативных метилотрофных бактерий ...
0 комментариев