Навигация
Применение метода ЯМР для определения концентраций
31074
знака
0
таблиц
7
изображений
6. Применение метода ЯМР для определения концентраций
Задача определения концентраций с помощью метода ЯМР в идеальном случае представляется достаточно простой. Так как площадь под резонансной линией пропорциональна числу ядерных спинов, то она пропорциональна также числу соответствующих ядер. При условии, что объем образца остается неизменным, число ядер пропорционально концентрации молекул, содержащих эти ядра. Это позволяет по величине площади определить значение относительных концентраций, а при соответствующей калибровке – значение абсолютных концентраций.
Рассмотрим вновь рис. Значения интегралов под отдельными резонансными линиями очевидно различаются. Соотношение площадей под сигналами, соответствующими гидроксильной, метиленовой и метильной группам, равно числу протонов в этих группах 1:2:3. Подобные рассуждения справедливы и при определении в смеси веществ относительных концентраций присутствующих в них компонентов. При этом здесь отсутствует необходимость в отнесении всех резонансных линий, необходимо лишь установить принадлежность хотя бы одной резонансной линии к соответствующей молекуле при условии, что в спектре отсутствует перекрывание спектральных линий.
Несмотря на относительную простоту такого подхода, существует, однако, ряд факторов, ограничивающих точность метода. Большинство источников ошибок можно достаточно просто исключить. Поскольку методы определения концентраций играют большую роль, в частности, в спектроскопии in-vivo, более подробно обсудим возможности устранения ошибок в таких экспериментах.
Эффекты насыщения могут существенно влиять на интенсивность резонансных линий. Так как значения времен продольной релаксации для различных групп в молекуле могут варьироваться в широких пределах, то возможно настолько сильное насыщение, что в результате будет наблюдаться полное исчезновение некоторых резонансных линий. Это происходит в том случае, если скорость повторения и соответственно длительность импульса, определяющая угол отклонения вектора намагниченности, выбираются слишком большими. Если же в образце присутствуют ядра с различными значениями времен релаксации и нужно провести измерение относительной интенсивности линий с достаточно высокой точностью, то необходимо построить эксперимент таким образом, чтобы соблюдался баланс между максимальной чувствительностью и правильным значением интегральной интенсивности резонансных линий. Максимальная чувствительность определяется углом Эрнста, а точное определение площади под резонансным сигналом достигается тогда, когда длительность интервала между импульсами выбирается из следующих соображений: спин ядра с наибольшим значением времени релаксации T^max должен полностью прийти к состоянию термодинамического равновесия, прежде чем на систему воздействует следующий импульс. Для достижения этого условия необходимо, чтобы интервал времени между импульсными воздействиями на спиновую систему Tr в несколько раз превышал максимальное из значений времен спин-решеточной релаксации Timax: например, Tr = Srjmax.
Так как возбуждающий импульс характеризуется конечной шириной, то соответствующий спектр не для всех частот будет равноинтенсивным. Если длительность импульса слишком велика, то не все резонансные линии возбуждаются равномерно, что приведет, очевидно, к изменению их интенсивности, которая определяется разностью значений резонансной и опорной частот.
Для улучшения отношения сигнал/шум РЧ сигнал подвергается фильтрации с помощью аналогового фильтра. Такой фильтр позволяет пропускать только интересующую нас область частот. Так как частотная характеристика для аналогового фильтра не является строго прямоугольной, то сигналы по краям спектра несколько ослаблены.
При использовании аналого-цифрового преобразователя сигнал, принимающий в аналоговом представлении непрерывный ряд значений, преобразуется в ряд целочисленных значений. В этом случае определение площади под резонансной линией будет неточным, если на частотной оси отсутствует достаточно число точек для характеристики резонансной линии. Точное измерение концентрации также невозможно в случае, если цифровая фильтрация загрубляет данные о площади под резонансной линией, слишком большой шум или перекрывание с другими сигналами затрудняет процесс интегрирования. Если входной сигнал, поступающий на АЦП, является очень слабым, то осуществляющая возможность проведения преобразования позволяет получить лишь достаточно грубую информацию, так как в нашем распоряжении имеется небольшое число значений для описания данного сигнала. В предельном случае имеется только одно значение – нуль. При этом интеграл определяется с большой неточностью. Неточность можно устранить, если усилить сигнал настолько, чтобы можно было располагать достаточным числом значений. Определенные трудности возникают тогда, когда одновременно необходимо проинтегрировать очень слабый и очень сильный сигналы. В этом случае максимальное усиление входного сигнала определяется динамической областью АЦП. В Фурье-спектроскопии полный сигнал должен быть зарегистрирован без искажений, так как каждая точка, содержащаяся в спаде свободной индукции, может оказывать влияние на весь спектр. Таким образом, даже самый большой сигнал должен попадать в область значений АЦП. Для современных спектрометров с высоким значением статического магнитного поля и соответственно высоким значением рабочей частоты, как правило, используются 12- и 16‑разрядные АЦП, т.е. наибольший сигнал может превышать не более чем в 4096 = 2* раз и соответственно не более чем в 65536=2 6 раз наименьший сигнал для того, чтобы можно было зарегистрировать эти сигналы одновременно. Несмотря на то что приведенные величины весьма велики, такая ситуация встречается на практике нередко. Если, например, нужно зарегистрировать спектр вещества миллимолярной концентрации в воде, то сигнал воды примерно в 1 10000 раз интенсивнее сигнала вещества.
Если учесть все перечисленные возможности возникновения ошибок, то при соответствующих условиях можно определять концентрацию с точностью до нескольких процентов. Если используем внутренний стандарт и добавляем строго определенное его количество, то можем достаточно точно определить значение абсолютной концентрации. Если же условия проведения эксперимента не позволяют использовать внутренний стандарт для определения интенсивности, то это означает, например, в спектроскопии in-vivo, что при нахождении абсолютных концентраций всегда допускается некоторая неточность. В этом случае интенсивность резонансных линий определяется многими внешними факторами, в частности, точным расположением образца в приемной катушке и точностью настройки приемно-передающего тракта. Точность этих измерений всегда должна подвергаться критической оценке и сопоставлениям.
7. Подавление интенсивного сигнала растворителя
Так как концентрация растворителя всегда превышает концентрацию растворенного вещества, то проблема детектирования слабых сигналов на фоне интенсивного сигнала растворителя возникает достаточно часто. Простейший метод, позволяющий обойти эту проблему, состоит в том, что выбирается растворитель, не содержащий ядер, положение резонансных линий которых совпадает с сигналами исследуемого вещества. Так, измерение спектров на ядрах 31P не вызывает затруднений, поскольку большинство из используемых растворителей не содержит атомов фосфора. Однако большинство растворителей содержит протоны, так что для них наблюдаются сигналы в спектрах ЯМР 1H. Данную трудность можно обойти, используя дейтерированные растворители, однако это также далеко не всегда применимо. Наиболее часто используемый растворитель – дейтерированная вода. В настоящее время налажен промышленный выпуск полностью дейтерированных растворителей, они нашли широкое применение. Если же по условиям проведения эксперимента необходимо использовать протонсодержащие растворители или сигнал остаточных протонов достаточно интенсивный, то этот сигнал необходимо подавлять с использованием специальных импульсных методов. Разнообразные методы, разработанные с этой целью, можно разделить на две категории: либо в подготовительном периоде эксперимента проводится селективное воздействие на спиновую систему на частоте, соответствующей сигналу растворителя, таким образом, чтобы в дальнейшем при неселективном воздействии интенсивность сигнала от растворителя была существенно ослаблена, либо возбуждается весь спектр, за исключением той области, в которой расположены сигналы растворителя. Наиболее эффективен подход, в котором используется комбинация этих методов.
Самым распространенным является метод селективного предварительного насыщения сигнала растворителя, в котором используется слабый импульс большой длительности. Следующий за ним неселективный импульс возбуждает весь спектр, однако за счет предварительного насыщения интенсивность пика растворителя существенно ослабляется в 100–1000 раз. Вторую группу составляют методы, основанные на инвертировании сигнала с помощью 180°-ного импульса и возбуждении спустя время Xполного спектра, причем длительность этого интервала выбирается такой, чтобы к моменту сбора данных намагниченность от сигнала растворителя была равна нулю.
Недостатком описанных выше методов является то, что в процессе проведения эксперимента влиянию подвергаются также и другие области спектра, в частности, возбуждаются сигналы, расположенные вблизи сигналов растворителя. В дальнейшем рассмотрим механизмы, обусловливающие, например, такие эффекты, как ядерный Оверхаузера и перенос поляризации.
Методы полуселективного возбуждения обладают тем преимуществом, что в них нежелательные эффекты отсутствуют. Полуселективные возбуждающие импульсы создаются либо в виде импульсов большой длительности и низкой интенсивности, либо в виде последовательности импульсов большой интенсивности. Первая группа методов позволяет получить спектр любого вещества, но реализация этих методов на стандартном спектрометре сопряжена со значительными трудностями, так как требует проведения специальной настройки и специального блока, который, кстати, входит в комплект ЯМР-томографа. На практике более часто используется простая в настройке импульсная последовательность 1331. Принцип работы этой последовательности состоит в следующем: отдельный импульс позволяет полностью «вырезать» определенную часть спектра, а во всей остальной области сигналы компенсируются не полностью, что позволяет провести их регистрацию. Недостатком этого метода является сложность корректировки фаз линий в спектре.
Похожие работы
... , основанной на поглощении атомами рентгеновского излучения. Ультрафиолетовая спектрофотометрия — наиболее простой и широко применяемый в фармации абсорбционный метод анализа. Его используют на всех этапах фармацевтического анализа лекарственных препаратов (испытания подлинности, чистоты, количественное определение). Разработано большое число способов качественного и количественного анализа ...
... измерения параметров открывают многообразные пути его применения в промышленности. Внедрению метода ЯМР препятствовали :сложность аппаратуры и ее эксплуатации, высокая стоимость спектрометров, исследовательский характер самого метода. 2.Общая теория ядерного магнитного резонанса. 2.1.Классическое описание условий магнитного резонанса. Вращающийся заряд q можно рассматривать как ...
... , а затем строят калибровочный график, с помощью которого выполняют расчеты. Спектрофотометрия в УФ- и видимой областях — один из наиболее широко используемых физико-химических методов в фармацевтическом анализе. Анализируемые ЛВ должны иметь в структуре молекулы хромофорные группы (сопряженные связи, ароматическое ядро и др.), обусловливающие различные электронные переходы в молекулах и ...
40566
0
0
... . На основе оптических методов («просвечивания» газового состава инфракрасным излучением) построена целая гамма газоаналитических приборов, принцип действия которых базируется на регистрации поглощения ИК-излучения газами и автоматического преобразования аналитического сигнала к единицам приведенного коэффициента поглощения. Степень поглощения энергии излучения зависит от концентрации ...
0 комментариев