Ферменты обмена вазоактивных пептидов

1.2.3 Ферменты обмена вазоактивных пептидов

1.2.3.1 Ангиотензинпревращающий фермент. Ангиотензинпревращающий фермент (КФ3.4.15.1, АПФ, ангиотензин - конвертирующий фермент, кининаза II, дипептидилкарбоксипептидаза I,) является ключевым ферментом, связывающим между собой ренин – ангиотензиновую и калликреин – кининовую системы. Фермент присутствует в плазме крови, нервных клетках, клетках почечных канальцев, сердечной мышце, матке, слюнных железах. Основная локализация в организме человека – эндотелий сосудистой стенки [3]. По структуре АПФ представляет собой гликопротеин, существующий в виде мембрано- связанной формы и являющийся интегральным белком. Молекула фермента, представляющая собой одну полипептидную цепь, локализована экстрацеллюлярно, гидрофобный трансмембранный участок включает 17 аминокислотных остатков и находится в положении 1230-1247, а внутриклеточный гидрофильный участок состоит из 30 остатков. Имеется и растворимая форма АПФ отличающаяся от мембраносвязанной отсутствием трансмембранного и внутриклеточного участков. Мембраносвязанная форма имеет молекулярную массу 170кДа и включает С- и- N-гомологичные домены, обладающие энзиматической активностью. Предполагается, что домены АПФ могут иметь разные функции в организме. Возможно, между N- и C-доменами имеется участок, доступный для ферментативного расщепления. Таким образом, N-домен может освобождаться или из находящегося в растворе полноразмерного фермента, или из мембраносвязанной формы, составляя С-домен на мембране [21]. В принципе такой процесс может происходить где угодно в организме. Вопрос о функциональной роли доменов до сих пор остается неясным. Однако полученные к настоящему времени данные об обнаружении эндогенных субстратов, специфичных для N-домена, и о разном взаимодействии ингибиторов АПФ с доменами, а также присутствие в организме однодоменных форм фермента свидетельствуют в пользу физиологической значимости доменов. Каждый из доменов содержит активный центр, которые отличаются по скорости гидролиза пептидов, по степени торможения специфичными ингибиторами АПФ [54,56].

АПФ – металлопротеиназа, которая содержит в активном центре ион цинка и активируется ионами Сl-, NO3- ,SO42-, ингибируется соединениями, содержащими SH-группу, хелаторами (ЭДТА, о-фенантролин), брадикининпотенциирующим фактором (K_i = 40 нм), 2-меркаптоэтанолом. Кроме того, существуют специфические ингибиторы АПФ – каптоприл (К = 20 нм), лизиноприл (К= 3-10 нм), и эналаприл (К =25-35 нм) [4,20].

рН-Оптимум действия АПФ составляет 7,2-7,6. Препараты АПФ, выделенные из различных органов человека (легких, сердца, печени, мозга, плазмы крови) существенно не различались по следующим физико-химическим параметрам: молекулярной массе, изоэлектрической точке, рН-оптимуму, константе ингибирования известными ингибиторами АПФ. При этом их иммунологические и каталитические свойства могут быть различными [21].

При действии на физиологические субстраты АПФ может вызывать либо превращение неактивной формы в активную, инактивацию биологически активного пептида, либо трансформацию его активности. Так, участвуя в отщеплении С-концевого гистидиллейцина от ангиотензина I, он превращает его в физиологически активный ангиотензин II, инактивирует брадикинин путем последовательного удаления двух С-концевых дипептидов, расщепляет такие функционально активные пептиды, как мет-энкефалин, нейротензин, эндорфин, вещество Р, (действуя в этих превращениях как эндопептидаза), играя роль одного из регулирующих факторов в обмене этих биологически активных веществ [20,36,41]. АПФ принимает участие в процессинге энкефалинов, гидролизуя энкефалинсодержащие пептиды - Met-энкефалин-Arg6-Phe7 в мет-энкефалин и Met-энкефалин- Arg 6-Glu7-Leu8 в Met-энкефалин-Arg6 [4].

АПФ является физиологическим регулятором концентрации в плазме пептида AcSDKP (N-AcSer-Asp-Lys-Pro), влияющего на пролиферацию гемопоэтических и других клеток.

Фермент участвует в регуляции артериального давления. Кроме того, он вовлечен в реализацию таких функций как репродуктивные процессы, защитные и иммунные реакции организма. Участие фермента в том или ином процессе определяется как его локализацией, так и особенностью действия на регуляторные пептиды [20,56]. Являясь фактором, связывающим ККС и РААС – систем, вовлеченных в регуляцию большинства функций организма, реагирует на изменения, возникающие при патологических процессах. В связи с этим представляет интерес изучение активности фермента у онкологических больных при химиотерапевтическом воздействии.

1.2.3.2 Карбоксипептидаза N. Карбоксипептидаза N (КФ 3.4.12.7. КП N, аргинин-карбоксипептидаза, кининаза I) обнаружена Erdos и соавт. в плазме крови человека в 1962 году. Названа так потому, что по свойствам и специфичности он близок к панкреатической карбоксипептидазе B, но отличается от нее тем, что не имеет неактивного предшественника. Относится к ферментам вневизикулярной локализации – внеклеточной жидкости и внешней поверхности цитоплазматических мембран. Фермент локализован в плазме крови, обнаружен в стенках кровеносных сосудов, слизистой оболочке носа, моче [13].

Фермент имеет Mr 280 кДа и состоит из четырёх субъединиц трёх типов: двух с Mr 88 кДа и по одной с Mr 55 кДа и 48 кДа. Субъединицы с Mr 88 кДа гликозилированы (на долю углеводов приходится 29% массы), не обладают ферментативной активностью и, по-видимому, стабилизируют фермент в плазме крови [61]. Субъединицы с Mr 48 кДа и 55 кДа обладают ферментативной активностью и не содержат в своём составе углеводных остатков [13,58].

КП N относится к металлокарбоксипептидазам. Активный центр фермента имеет форму кармана, в полости которого находится ион Zn²⁺. В цельной сыворотке крови человека фермент активируется ионами Co²⁺ и в меньшей степени Ni²⁺, инактивируется ионами тяжелых металлов, бензоилом–L-аргинином, и хелатными соединениями. Тормозящее действие ингибиторов КП N проявляется не только в опытах in vitro, но и in vivo. При внутривенном введении ингибитора (2-меркаптоэтанол, ЭДТА) усиливалось гипотензивное действие брадикинина. Каталитическая активность фермента оптимальна при pH 7,0 – 7,8, и зависит от природы буферной смеси. В фосфатном буфере максимум активности находится при pH 7,5; в зоне pH 7,0 – 6,0 наблюдается резкое падение активности; в трис-буфере pH – оптимум составляет 7,0. Фермент чувствителен к кислой среде. При pH среды 2,0 – 3,0 он инактивируется необратимо, а при pH 6,5 – 5,0 – обратимо. Трапезникова С.С. и Пасхина Т.С. провели работу по изучению свойств карбоксипептидазы N из сыворотки крови человека, очищенного в 273 раза. Полученные препараты, по данным ультрацентрифугирования, состояли из двух компонентов с константой седиментации 5,3S и 6,5S. Отмечена четко выраженная зависимость фермента от температуры: максимальная активность проявляется при 37°С, при 30°С она снижается наполовину. Лиофилизированные препараты сохраняют свою активность в течение 6 месяцев [4,13].

Помимо способности отщеплять С-концевой аргинин в брадикинине (истинная кининазная активность) и Met⁵-энкефалин-Arg⁶, лизин в Met⁵-энкефалина-Lys⁶, карбоксипептидаза N гидролизует более простые синтетические субстраты: гиппурил-L-аргинин, гиппурил–орнитин (пептидазная активность), а также расщепляет эфиры гиппурил-L-аргининовой кислоты [27]. При этом скорость расщепления субстратов, содержащих C-концевые остатки лизина в 5-6 раз выше, чем соответствующих пептидов с C-концевым аргинином. Скорость расщепления гиппурил-аргининовой кислоты в несколько раз выше, чем гиппурил-аргинина. Эстеразная активность фермента угнетается ионами тяжелых металлов, в особенности Cd²⁺ , а также аргининовой кислотой и ЭДТА [13].

Биологическая роль КП N во многом остаётся неясной. Инактивируя брадикинин, она способна вовлекаться в регуляцию артериального давления и тонуса кровеносных сосудов. Однако реальный вклад фермента в инактивацию брадикинина in vivo не превышает 10-12%. Некоторые авторы предполагают, что КПN может играть роль модулятора действия брадикинина [57,62].

Активность КПN изменяется при воспалительных и аллергических реакциях, так как подкисление реакции среды в тканях будет способствовать накоплению кининов из-за торможения кининазной активности фермента. Поскольку фермент расщепляет пептиды, участвующие в развитии воспалительных реакций (брадикинин и анафилотоксины), и его активность в крови снижается при введении рекомбинантного интерлейкина-1b, вероятно, что КПN вовлекается в развитие воспалительных реакций [52,63].

Фермент участвует не только в процессинге энкефалинов, но и в их инактивации. Являясь основным ферментом ККС, он участвует в морфогенезе клеток, увеличении проницаемости сосудистой стенки, регуляции активности каскадных протеолитических систем плазмы крови: гемокоагуляции, фибринолиза, комплемента, развитии злокачественных новообразований [13,52].

Таким образом, КП N вносит вклад в регуляцию многих физиологических процессов и развитие патологических состояний. Поэтому, представляет интерес исследование активности фермента при онкологических заболеваниях в период химиотерапии.