Навигация
Гібридизація клітин у культурі
40655
знаков
0
таблиц
1
изображение
2.1 Гібридизація клітин у культурі
У I960 р. було показано, що при спільному культивуванні клітин двох різних ліній вони можуть зливатися, утворювати гібриди, які містять геноми обох батьківських форм. Перші гібридні клітини були отримані при злитті клітин різних ліній мишей, які культивувались Крім внутрішньовидових отримані і міжвидові гібриди, наприклад, між клітинами людини і миші, миші і хом'ячка і навіть миші і курчати.
Утворення гібридних клітин відбувається набагато частіше, якщо в культуру додані деякі речовини, наприклад поліетиленгліколь або інактивовані віруси. Для цієї мети часто використовують вірус Сендай. У вірусів звичайно є один і більш специфічних ділянок, завдяки яким вони можуть зв'язуватися з рецепторами клітини-хазяїна. На поверхні вірусу Сендай таких ділянок небагато. Таким чином, одна вірусна частка здатна утворити місток, з'єднавшись відразу з двома клітинами. Внаслідок дуже малого розміру вірусної частки клітини виявляться надзвичайно тісно зближені. При цьому може відбутися злиття плазматичних мембран клітин і утворитися дикаріон - клітина з двома ядрами. Потім ядра також можуть злитися з утворенням синкаріону, який містить хромосоми обох батьків. По незрозумілим причинах протягом декількох перших розподілів гібридної клітини відбувається швидка втрата хромосом одного з поєднуваних видів. У клітинних гібридів миша-хом'ячок відбувається втрата хромосом миші. У гібридів кліток миші і людини втрачаються хромосоми людини. Звичайно через 30 поколінь гібридна клітинна лінія миша-людина містить повний хромосомний набір миші і тільки сім людських хромосом. Ця цифра є середньою, деякі клітини містять тільки одну-дві пари людських хромосом, тоді як інші 20. Одна клітинна лінія, хромосоми якої втрачаються після злиття, називається донорною, а інша - реципієнтною. Варіабельність втрати хромосом людини в клітинних гібридів мишей-людин полегшує картування людських генів. Для картування генів миші використовують клітинні гібриди миша-хом'ячок. Якщо присутність продукту досліджуваного гена корелює з наявністю якої-небудь однієї хромосоми в гібриді, то цей ген, швидше за все, локалізований у цій хромосомі. Повинні дотримуватися дві умови. По-перше, досліджувана ознака, яка кодується хромосомами людини, повинна чітко (на клітинному рівні) відрізнятися від аналогічної ознаки миші. Наприклад, досліджувана лінія клітин людини містить мутантну лактатдегідрогеназу A (LDH-A). Цей фермент відрізняється від білка, який кодується відповідним мишачим геном. Ці дві форми легко розділяються при гель-електрофорезі. Друга умова, необхідна для картування - можливість ідентифікації даної людської хромосоми, яка присутня у досліджуваній клітинній лінії.
Зчеплення генів у соматичних клітках запропоновано називати синтенією, від грецького "син" - спільно, "тіні"-підтримувати. Цей термін уведений для того, щоб відрізняти дані про хромосомну локалізацію, отримані в дослідах із соматичними клітинами, від результатів по зчепленню генів, отриманих при аналізі родоводів. Якщо два гени присутні або обоє відсутні в гібридних клітинних лініях, то вони називаються синтеничними.
2.2 Відбір клітинних гібридів за допомогою методу НАТ
Втрата хромосом у гібридів між клітинами миші і людин - це випадковий процес. Те, яка хромосома збережеться і стабілізується в гібридній лінії, випадковий процес. Однак із усієї популяції гібридних клітин можна відібрати стабільні лінії, які містять бажані гени і хромосоми, використовуючи селекційні методи. Ці процедури аналогічні тим, що використовуються для добору певних класів рекомбінантів, які утворяться при схрещуваннях бактерій або дріжджів.
Відсутність у батьківської лінії мишачих клітин якої-небудь істотної функції, наприклад здатності синтезувати необхідний метаболіт, може бути супресовано при внесенні елементів геному людини. З такої гібридної лінії можуть поступово втратитися всі людські хромосоми, крім тієї, котра містить ген, відповідальний за незамінну функцію. Таким чином, можна відібрати гібридні клони, які містять конкретні людські хромосоми. Такий попередній добір полегшує картування генів, розташованих у цій хромосомі.
Один дуже широко використовуваний метод добору гібридних кліток називається НАТ-селекцією. Це назва-абревіатура англійських назв речовин: гіпоксантина, аміноптерина і тимідина, які присутні у селективному середовищі. Аміноптерин блокує синтез пуринів і піримідинів. Для того щоб синтезувати ДНК, клітини повинні реутилізувати пурини і піримідини, які утворяться при деградації полінуклеотидів. В обміні нуклеотидів бере участь велика кількість ферментів. Один з цих ферментів - тимідинкіназа (ТК), яка здійснює перетворення тимідину в тимідинмонофосфат. Якщо у мутантній лінії клітин миші, яка використовується відсутній цей фермент, то на селективному середовищі HAT, в якому відсутній тимідинмонофосфат, можуть рости клітини, які одержали хоча б одну з гомологічних хромосом людини, які містять ген ТК. Цитологічні дослідження показали, що всі клітинні лінії, які відбираються, містять 17 хромосому людини. За допомогою таких клітинних ліній можуть бути картовані й інші гени людини (крім гена ТК), локалізовані на сімнадцятій хромосомі. Задача зводиться до ідентифікації продуктів генів людини, що напрацьовуються у відібраних гібридних лініях.
Селективне середовище HAT може бути використана для добору клонів, які містять і інші хромосоми. Наприклад, фермент фосфорибозил-гіпоксантин-трансфераза (HPRT) бере участь у синтезі пуринів. Якщо лінія кліток миші втрачає здатність синтезувати HPRT, то цей дефект може бути відшкодований присутністю відповідного гена людини. Показано, що всі гібридні клони, відібрані за цією ознакою, містять людську Х-хромосому, у складі якої знаходиться ген HPRT. Розроблено інші селективні схеми, що дозволяють проводити картування генів, локалізованих і на інших хромосомах, крім X і 17.
Похожие работы
... і всіх розв'язних документів, необхідна певна законодавча база, що дозволяє у випадках появи негативних наслідків з юридичної точки зору вирішити проблему, що створилася. 1. Теоретичні основи генно-модифікованих продуктів Генетична інженерія - це нова галузь молекулярної біології, яка розробляє методи перенесення генетичного матеріалу від одного живого організму до іншого з метою ...
... – ПЛР аналіз ДНК трансфікованих клітин; виявлення АРОА1 людини в плазмі крові піддослідних кролів та культуральному середовищі трансфікованих клітин. АНОТАЦІЯ Гільчук Ю. М. Ефекти, обумовлені введенням у клітини ссавців трансгена аполіпопротеїну А-1 людини. – Рукопис. Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.22 – молекулярна генетика. – І ...
... "IQ"), що відображає серед іншого і здатність логічно мислити, у жінок значно вище, ніж у чоловіків. Досліджуючи роль статі у феномені геніальності, не можна не сказати і про ще одне типове уявлення. Існує думка, що геніальність пов'язана з гомосексуальністю, і існують численні приклади геніїв-гомосексуалістів (Мікеланджело, О.Уайльд, П.Чайковський). Однак вважати гомосексуальність істотною ...
алізовані, він так поставив свої досліди й опрацював результати, що міг дати точний кількісний аналіз успадкування і перекомбінування елементарних спадкових ознак в ряді поколінь. З одержаних таким чином експериментальних даних він зміг сформулювати ймовірнісно-ствтисичні комбінаторні закономірності успадкування і побудувати гіпотезу спадкових факторів і чистоти гамет. У цьому Мендель випередив ...
0 комментариев