Приготовление зонда на основе гена 111 фага М13

1.2.1 Приготовление зонда на основе гена 111 фага М13

Тандемные повторы М13 локализуются в положениях 1700–1900 и 2300–2500 фагового генома. Можно использовать эти данные и свойства фагового вектора для синтеза гибридизационного зонда с высокой удельной активностью. После отжига 17-нуклеотидного секвенационного праймера на одноцепочечной ДНК-матрице любого из фагов М13 серии и достройки второй цепи фрагментом Клёнова с участием меченых дезоксинуклеозидтрифосфатов, реакцию останавливают добавлением соли. Если время инкубации выбрано таким образом, что удвоение цепи происходит не далее гена III, то вновь синтезированная цепь длиной до 4,5 т. п.н. содержит меченые нуклеотиды, а проксимальная часть генома фага М13 длиной 2,5 т. п.н., имеющая тандемные повторы, остается одноцепочечной. Это позволяет тандемному повтору гибридизоваться с комплементарными последовательностями ДНК, иммобилизованной на фильтре, и тем самым делает возможным использование меченой ДНК фага в качестве гибридизационной пробы. После освобождения от невключившихся меченых нуклеотидов можно измерить удельную активность ДНК-зонда, которая обычно варьирует в пределах 1–2ХЮ⁹ имп./мин/мкг ДНК матрицы. Однако, по-видимому, очистка зонда на колонке с сефадексом, снижает его гибридизационную активность, поэтому лучше избегать этого этапа и использовать в качестве зонда полученную реакционную смесь без дальнейшей ее очистки.

2. Гель-электрофорез и перенос ДНК

С обзором методов гель-злектрофореза можно познакомиться в работе. Однако полезно все же вкратце выделить специфические условия, повышающие эффективность анализа методом геномной дактилоскопии.

2.1 Выбор фермента рестрикции

Обсуждаемые молекулярные основы вариабельности членов семейств ГВР заключаются в разном количестве повторяющихся единиц в каждом ГВР-локусе. Чтобы выявить вариации подобного рода с возможно большим разрешением, необходимо гидролизовать ДНК ферментом рестрикции, который расщепляет достаточно часто, но не нарушает целостности повторяющихся единиц ГВР. Для обсуждаемых ГВР удобно использовать рестриктазы HinW, Mbol, AluA и Haelll.

В некоторых случаях встречаются фрагменты с такими близкими значениями Ш, что их нельзя разрешить на картине фореза. Тогда полезно повторить эксперимент с использованием другого фермента. При этом имеет место «перетасовка» рестриктов ГВР, что дает нам лишний шанс разделить сомнительные полосы. Когда используется фермент рестрикции, узнающий четырехнуклеотидную последовательность, эффект «перетасовки» обычно едва заметен, особенно для высокомолекулярных фрагментов, так как вклад в величину этих фрагментов фланкирующих последовательностей невелик, независимо от того, какой фермент используется. Тем не менее, некоторые полосы можно идентифицировать благодаря тому, что их подвижность по другим ферментам будет лишь немного изменена. Для достижения эффекта «перетасовки» наиболее подходящим считают фермент рестрикции Haelll.

2.2 Приготовление образцов ДНК для электрофореза

ДНК, получаемая обычным способом, обладает достаточно хорошим качеством для проведения анализа методом геномной дактилоскопии. Наилучшие результаты получают, если на дорожку приходится 1–5 мкг ДНК. Поскольку имеет значение не только присутствие, но и интенсивность отдельной полосы, важно достичь равномерного распределения материала между всеми дорожками геля. Хорошо известно, что измерения оптической плотности растворов ДНК дают ненадежные значения концентраций, которые могут рассматриваться только как грубые оценки. Для проверки полноты рестрикции и правильности нанесения необходимо поставить контрольный форез с аликвотами гидролизата ДНК и на основе этого подобрать оптимальное количество наносимой пробы.

Иногда для уменьшения наносимого объема бывает нужно осадить ДНК из рестрикционной смеси, но обычно в этой процедуре все же нет необходимости: хорошие результаты получаются и без этапа очистки. Если образец был осажден, очень важно промыть его 70%-ным этанолом для удаления избытка соли, которая нарушает подвижность фрагмента ДНК; важно также высушить осадок под вакуумом перед растворением» иначе присутствие следов этанола вызовет флотацию материала из лунок при нанесении.

2.3 Условия электрофореза

Оптимальные условия электрофореза для геля, используемого при геномной дактилоскопии, определяются требованиями к информативности получаемых отпечатков ДНК. Если данные необходимы для подтверждения структуры родословной или для окончательного уточнения картины в случае неудачно прошедшей гибридизации, или для сравнения образцов ДНК из разных тканей индивида, то желательно получить информацию о возможно большем числе полос, поддающихся разрешению. Для этих случаев наиболее удобно использовать 1%-ный агарозный гель и вести форез при 2 В/см в течение 48 ч с двумя сменами форезного буфера. Такие условия обеспечивают разрешение полос в диапазоне 2–25 т. п.н. Для сегрегационного анализа более важно достичь хорошего разделения наиболее высокомолекулярных гиперполиморфных фрагментов. В этом случае следует вести форез в 0,8%-ном геле при 1,5 В/см в течение 72 ч с пятью сменами форезного буфера. При этих условиях все фрагмент короче 3 т. п.н. выходят из геля, и в нем остаются оптимально разделенными более информативные длинные фрагменты, по которым наблюдается высокая степень гетероаиготности.

2.4 Перенос по Саузерну

После проведения электрофореза гель окрашивают бромидом этидия, и для оценки полноты проведения фореза и регистрации картины разделения фрагментов относительно маркеров размера гель фотографируют в УФ-свете.

Наиболее критическим моментом в приготовлении отпечатков ДНК с помощью зондов на основе ГВР является гибридизация и отмывка фильтров. Оптимальные условия варьируют в зависимости от характера зондов.