Использование метода геномной дактилоскопии в анализе генетического сцепления

3. Использование метода геномной дактилоскопии в анализе генетического сцепления

3.1 Обоснование метода

Методический подход, получивший название «обратная генетика» и оказавшийся очень полезным при изучении наследственных заболеваний, в настоящее время взят на вооружение широким кругом исследователей. За последние годы наши представления о мышечной дистрофии Дюшенна, муковисцидозе и ретинобластоме значительно расширились. Если раньше усилия ученых были направлены на выяснение закономерностей наследоцания заболеваний, то сейчас на повестке дня стоит вопрос о локализации и молекулярной характеристике генов, ответственных за эти болезни.

Изучение большинства наследственных заболеваний шло именно таким путем. В некоторых случаях хромосомная локализация интересующего гена устанавливается достаточно легко. Это бывает, если у индивидов с аберрантным фенотипом наблюдаются устойчивые аномалии в определенной области хромосомы. К сожалению, для большинства наследственных заболеваний такая благоприятная в плане диагностики ситуация не характерна и для локализации гена необходимо проводить анализ генетического сцепления.

Применение ПДРФ в анализе сцепления стало обычной процедурой и значительно ускорило процесс картирования. Однако этот подход имеет и некоторые недостатки. В большинстве случаев ПДРФ представляет собой всего лишь диморфизм, и соответствующие локусы не могут поэтому характеризоваться более чем 50%-ной гетерозиготностью. Для того чтобы данное скрещивание дало какую-нибудь информацию о сцеплении, по крайней мере один из родителей должен быть гетерозиготным как по интересующей, так и по маркерной области.

Таким образом, большая часть семей, подвергнутых анализу на сцепление с применением ПДРФ, окажется совершенно неинформативной. Это пример неэффективного использования информационных ресурсов родословной. Как инструмент в анализе сцепления метод геномных отпечатков нашел применение в случаях тех заболеваний, биохимическая природа которых пока неизвестна или когда приуроченность к подозреваемому гену была исключена. Поскольку не существует простого метода определения, какая из полос «отпечатка» генома данного индивида представляет ту или иную полосу в картине другого индивида, обычная процедура получения данных о сцеплении по нескольким малым родословным невозможна. Сложность гибридизационных картин не позволяет достоверно проследить наследование аллельных пар, но в рамках большой родословной и, конечно же, в груше сибсов отдельный фрагмент данного размера может рассматриваться для простоты предварительного анализа как отдельный локус. По этой причине наличие одной большой родословной является обязательным требованием для традиционного сегрегационного анализа полос в геномном «отпечатке». Такие родословные редко когда можно получить для рецессивно наследуемых нарушений, однако для доминантных заболеваний – это реально.

Для сегрегационного анализа полос в «отпечатках» ДЬЩ в силу допущенного упрощения, сделанного в отношении их аллелизма, классический метод правдоподобия не может быть, применен. В данном случае допустима лишь оценка шансов на сцепление. Таким образом, метод следует рассматривать как быстрый предварительный анализ на сцепление. Если результат окажется обнадеживающим, т.е. если в отпечатках будет найдена полоса, наличие которой для данной родословной коррелирует с экспрессией аномального фенотипа, то эту полосу следует выделить и клонировать. Таким путем можно получить локус-специфичный зонд и с его помощью проанализировать другие родословные с целью подтвердить или отвергнуть наличие сцепления.

Недостаток больших родословных для рецессивно наследуемых признаков, конечно, ограничивает применение метода геномной дактилоскопии, но не исключает полезность его использования для анализа рецессивных болезней. Если в родословной имеются близкородственные браки, возможно также картирование по гомозиготности. Суть этого метода в следующем: если оба родственных индивида несут редкий рецессивный тен_у то вероятнее всего они унаследовали его от единого предка. Если индивиды находятся в достаточно далеком родстве, то общие для них последовательности будут составлять лишь малую долю генома. К тому же поскольку аллельные частоты фрагментов, образующих полосы в отпечатках, очень малы, то маловероятно, что в геноме родственников эти фрагменты совпадут, если они произошли от разных предков. Если при близкородственном скрещивании больные дети имеют общую для их геномных отпечатков полосу в удвоенном количестве, а здоровые дети наследуют одинарную дозу или вовсе не имеют этой полосы, то тем самым подтверждается гипотеза о физическом сцеплении между участком, ответственным за признак, и данной полосой. Условившись об аллелизме, можно подсчитать шансы на сцепление, но, как уже отмечалось, для подтверждения или опровержения наличия сцепления фрагмент необходимо клонировать.

3.2 Статистические расчеты

На блоте среднего качества с помощью одной пробы можно проследить до 10–20 полос, что в сумме для трех проб дает 30–60 маркеров. Генетические данные указывают на то, что не существует заметной кластеризации ГВР, поэтому есть основания предположить их независимое расположение. Вероятность Р того, что по крайней мере один из 45 независимо расположенных маркеров находится на генетическом расстоянии в 15% от сайта, ответственного за признак, может быть оценена с помощью алгоритма Элстона и Ланга равной приблизительно 0,33. Таким образом, при наличии соответствующей родословной этот метод позволяет успешно обнаружить сцепление.

Необходимо определить критическое значение вероятности сцепления с тем, чтобы после подсчета этой вероятности на основе предварительного анализа отпечатков можно было сделать заключение о необходимости следующей стадии – клонирования «подозрительной» полосы. В классических методах правдоподобия критическое значение лод-балла составляет 3: г=3; лод-балл, превышающий 3, рассматривается как свидетельство в пользу сцепления. Учитывая, что затраты на клонирование фрагмента достаточно велики, для перехода к этому этапу оправданным представляется требование уверенного превышения критической величины лод-балла на этапе предварительного анализа. Как же рассчитываются шансы на сцепление?

Легко получить численную оценку рекомбинации между маркерной областью и участком, ответственным за признак:

где г – количество рекомбинантов, п – общее количество возможных рекомбинаций.

Исходя из этого, обычным путем можно получить соотношение для оценки вероятности сцепления:

и

Это соотношение не учитывает поправку на использование множественных маркеров. Заметим, однако, что существуют некоторые сомнения в необходимости коррекции результатов в тех случаях, когда используется менее 100 маркеров. По мнению Отта, при увеличении количества маркеров с ростом вероятности ошибочного выявления сцепления растет и вероятность того, что хотя бы один из маркеров действительно сцеплен с изучаемым признаком, при этом последняя вероятность растет быстрее, чем первая, поэтому доля истинных сцеплений среди всех выявленных не уменьшается. Являясь математически убедительным, этот вывод противоречит интуиции. Высокий уровень ошибочных позитивных ответов на предварительном этапе сделал бы метод отпечатков малоинформативным. В связи с этим представляется целесообразным сделать условие перехода ко второй стадии анализа более строгим, подняв значение порога. В будущем при наличии более убедительной модели, описывающей эту задачу, можно было бы/его снизить.

3.3 Практические аспекты сегрегационного анализа

3.3.1 Минимальный размер родословных

Для того чтобы сегрегационный анализ полос в отпечатках ДНК сибсов был информативным, необходимо изучить не менее 10 мейозов. Такое количество сибсов далеко не всегда доступно для изучения, и поэтому приходится проводить сегрегационный анализ по большой родословной.

Для фрагментов короче 3 т. п.н. частота встречаемости одного и того же фрагмента у индивидов, не находящихся в родстве, очень мала. Таким образом, необязательно иметь для ис_т следований образцы ДНК обоих родителей близнецов; при наличии отпечатков ДНК одного из родителей отпечатки второго можно восстановить с высокой степенью достоверности. Если есть ДНК обоих родителей, то образцы следует разгонять на форезе в соседних дорожках геля. В этом случае фрагменты в геномных отпечатках потомков можно с легкостью отнести к тому или иному родителю.

3.3.2 Пример с сегрегационного анализа, проводимого с помощью метода геномных отпечатков

Ниже приводится пример анализа наследования полос в геномных отпечатках отдельной широкой сибсовой ветви.

Из-за несовершенства агарозного геля при электрофорезе лучше ие использовать для считывания данных отпечатков компьютерную технику, а «прочитать» их «вручную». Это легко проделать, если отдельно исследовать каждого из сибсов, параллельно проводя сегрегационный анализ полос в отпечатках каждого из родителей. Удобно присваивать полосам одного родителя цифры, а полосам другого – буквы.

После регистрации и отсчета полос для каждого из сибсов можно проанализировать полученные результаты на наличие сцепления. Если рассматривается гипотеза сцепления локуса, ответственного за изучаемый наследственный дефект, с какой-либо из полос в отпечатках ДНК больного родителя, то можно сосчитать число рекомбинантных и нерекомбинантных индивидов, численно оценить долю рекомбинантов и рассчитать вероятность. Эта процедура проделывается для каждой из полос в отпечатках ДНК больного родителя.